腫瘤耐藥基因檢測的臨床應用

摘 要 目的：探討耐藥基因組合檢測的臨床應用問題和表達結果與藥物間在個體化化療中的適配分析。方法：90例惡性腫瘤病例，應用免疫組化染色檢測耐藥基因TS、GST-Pi、TOPOⅡ和Ki-67的表達結果用以指導臨床化療；以定性結果與不同的半定量表達法結合指導選藥作適配分析。結果：總的陽性表達率TS48%，GST-Pi69%，Ki-67和TOPOⅡ均為99%，而同一耐藥基因表達產物在不同類型腫瘤組織中的陽性表達率，TS為41%~100%，GST-Pi為24%~91%；在陽性半定量中，TS為10%~60%，GST-Pi和TOPOⅡ均為10%~80%，Ki-67為10%~90%。三組適配分析方案中，以定性結果指導選藥，兩類以上藥物適配的病例只有66%；而以定性結合分級定量結果指導選藥可達到80%；再以定性聯合百分比定量結果指導選藥則上升到99%。結論：TS、GST-Pi、TOPOⅡ和Ki-67組合檢測，基本上滿足各類惡性腫瘤耐藥基因的檢測需要；定性聯合百分比定量結果指導選藥能夠達到“個體化”的最佳適配。

關鍵詞耐藥基因 臨床應用 半定量表達法 藥物適配

資料與方法

選擇2005年7月~2006年8月在我院行手術治療患者，患方同意該項檢測的，術前未使用化療、放療和免疫治療的惡性腫瘤病例的術后標本90例。男51例，女39例。年齡10~79歲，平均53歲。樣本包括：腺癌41例，鱗癌18例，乳腺浸潤性導管癌11例，非霍奇金惡性淋巴瘤5例，浸潤性小葉癌2例，滑膜肉瘤2例，大細胞間變型淋巴瘤、霍奇金惡性淋巴瘤、多型性膠質母細胞瘤、骨巨細胞瘤、肝細胞癌、上皮樣平滑肌肉瘤、胃間質腫瘤、粒層細胞瘤、無性細胞瘤、惡纖組和惡性神經鞘瘤各1例。

標本處理和免疫組化染色：標本均用4%中性甲醛固定，組織處理溫度≤60℃，石蠟包埋，每例選擇1個典型腫瘤蠟塊，連續切片厚4μm。玻片用2%APES的純丙酮溶液涂布。應用標記的葡聚糖-聚合物免疫組化染色法（LDP兩步法），采用3%H2O2孵育阻斷內源性過氧化物酶、檸檬酸緩沖液高壓鍋抗原修復。

定性分析:①陽性：TS和GST-Pi胞漿/胞核胞漿均染成棕黃色，TOPOⅡ和Kl-67胞核染成棕黃色則判為陽性細胞［2］。②陰性：TS和GST-Pi胞漿無著色，TOPOⅡ和Ki-67胞核無著色，或與背景顏色一致，或陽性細胞＜5%則判為陰性。

半定量分析:①分級表達法（DAKO 基因公司推薦的常用標準）: 陽性細胞數5-25%（+），25-75%（+[KG-*2]+），＞75%（+[KG-*2]+[KG-*2]+）。②百分比表達法（我們摸索的標準，理論根據見討論部分）：陽性細胞數精確到10%。

結 果

切片染色背景清晰，陰性與陽性細胞對比鮮明。

統計分析:①定性分析結果見表。②半定量分析結果：a.分級表達結果：TS:（+）21例，（+[KG-*2]+）22例；GST-Pi：（+）11例，（+[KG-*2]+）48例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）3例；TOPOⅡ：（+）23例，（+[KG-*2]+）65例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）1例；Ki-67：（+）9例，（+[KG-*2]+）72例，（+[KG-*2]+[KG-*2]+）8例。b.百分比表達結果：TS：32%（10~60）；GST-Pi： 49%（10~80）；TOPOⅡ：36%（10~80）；Ki-67：53%（10~90）。

討 論

結果分析:①兩種半定量表達法比較在定性分析中，三種耐藥基因的陽性表達率均較高，而同一耐藥基因表達產物在不同類型腫瘤組織中的陽性表達率亦有差異，表明相同類型腫瘤個體間和不同類型腫瘤間均存在耐藥差異，故耐藥基因檢測具有重要的臨床意義。在半定量分析中，三種耐藥基因陽性定量在各個體間變異較大（10%~90%），分級表達法中25%與75%的陽性表達細胞數劃分在同一級中，其差異太大，不能精確反映出個體間的變異，從分級表達統計結果中可見（+[KG-*2]+）均占陽性病例的大部分，表明直接影響總體精確度的反映；而百分比表達法精確到10%時，即使誤差也不會導致如此大的表達值差異，從而較精確地反映出個體化的具體變異值，而且有助于選擇藥物與耐藥基因表達結果間達到最佳適配（見后文），也可根據個體對各類藥物敏感細胞的比例作為相應藥物用量比例的參考；配合Ki-67的表達結果，有助于周期特異性與非特異性抗癌藥物的較好搭配與選擇。由于Topo II也作為細胞增殖指數［１］，基本上可替代Ki-67表達的意義，但我們的結果中Topo II半定量（36%）低于Ki-67（53%），并不能完全替代Ki-67表達的意義。②根據耐藥機制將耐藥基因檢測陽性結果與不同的半定量表達法結合直接影響化療選藥與檢測結果間的適配；三種適配分析方案中，如果僅以定性結果指導選藥，達到兩大類以上藥物適配，即兩類以上藥物敏感細胞百分比之和達到110%~200%的病例只有66%；如以定性結合分級定量結果指導選藥，達到上述標準的病例可達到80%；若以定性聯合百分比定量結果指導選藥達到同樣標準的病例則上升到 99% (僅1例乳腺浸潤性導管癌為一類藥物適配，但GST-Pi與ER、PR的表達呈負相關［3］，本例ER、PR亦陽性）；結果表明三種方案中以定性聯合百分比定量結果指導選藥能達到二者間的最佳適配，更精確地反映“個體化”特點，且在同等檢測條件下獲得優于其他方法的效果，則最大限度地利用了資源。如果增加目前進入臨床的耐藥基因抗體的檢測種類，因其耐藥譜與上述重疊，不能擴大耐藥譜，故只宜與耐藥譜相近的耐藥基因抗體互換應用；如果減少檢測種類，耐藥譜過窄，可能出現無效檢測，不能為患者提供有效的藥物選擇數據，也不能滿足絕大多數類型惡性腫瘤的耐藥檢測需要，最終將使耐藥基因檢測無法推廣應用。

結論:應用TS、GST-Pi、TOPOⅡ三項耐藥基因和Ki-67組合檢測，基本上滿足各種類型惡性腫瘤的化療選藥需要，采用定性加百分比定量表達結果指導選藥能獲得二者間的最佳適配，用以指導化療是有效解決腫瘤耐藥的重要途徑之一。

參考文獻

1廖海濤，韋義萍，覃洪. 乳腺癌組織中耐藥基因和抑癌基因表達與化療耐藥的關系.中國醫學文摘腫瘤學，2005，19（1）：62~63

2 李甘地，劉衛平，張尚福，等. 現代組織病理技術.第四版. 成都：四川大學華西臨床醫學院病理學教研室，2001，37

3 徐光輝，葉勝龍，鄭義同，等. 人乳腺癌中3種耐藥基因產物的表達及其與預后的相關性. 復旦學報（醫學版），2005，32（1）：33~39