高效液相色譜法測定乙肝解毒膠囊中大黃素和大黃酚含量

摘 要 采用高效液相色譜法測定乙肝解毒膠囊中大黃素和大黃酚的含量。色譜柱：Shim-Pack C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）；流速：1.0ml/分；檢測波長：254nm；柱溫40℃；進樣量10μl。大黃素在0.435～34.816μg/ml濃度范圍內，峰面積積分值與濃度呈良好的線性關系（r=0.9999）；大黃酚在0.963～77.056μg/ml濃度范圍內，峰面積積分值與濃度呈良好的線性關系（r=0.9999），平均回收率為98.8%，RSD=0.8%(n=6)。本方法簡便、準確、重現性好。

關鍵詞 乙肝解毒膠囊 大黃素 大黃酚 高效液相色譜法

儀器與試藥

儀器：日本島津2010AHT高效液相色譜儀，Class-vp工作站，日本島津UV－260紫外分光光度計，北京賽多利斯天平有限公司BP211D電子分析天平，濟寧市中區魯超儀器廠LC-250超聲清洗機（250W 50kHZ ）。

試藥：大黃素對照品（批號：0756-200110 供含量測定用）、大黃酚對照品（批號：110796-200310 供含量測定用）均由中國藥品生物制品檢定所提供，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水，乙肝解毒膠囊及陰性樣品由吉林省吉特藥業有限公司提供（樣品批號：050101，050102，050103）。

方法與結果

色譜條件：色譜柱：Shim-Pack C18（250mm×4.6 mm， 5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）；流速：1.0ml/分；檢測波長：254nm；柱溫40℃；進樣量10μl。在此色譜條件下，大黃素的保留時間為12.44分鐘，大黃酚的保留時間16.43分鐘。大黃素的理論板數為11 265，大黃酚的理論板數為12 286。

對照品溶液的制備：分別精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加甲醇制成每1ml含大黃素4μg、大黃酚8μg的混合溶液即得。

供試品溶液的制備：取本品內容物約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25ml，置圓底蒸餾瓶中，蒸干，殘渣加水20ml，加鹽酸2ml，加氯仿20ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿層，水層用氯仿振搖提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液的制備：取缺大黃的陰性樣品適量，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

干擾試驗：取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按上述色譜條件測定。樣品色譜圖中與對照品溶液有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液在此保留時間無此峰，說明乙肝解毒膠囊的其他成分對大黃素和大黃酚的測定無干擾。證明本法可行。

線性關系考察：分別精密吸取大黃素對照品儲備液（每1ml含40μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml和大黃酚對照品儲備液（每1ml含80μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分別置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進行測定，以峰面積A對對照品濃度C作線性回歸。得大黃素回歸方程為：A=39 832C+4229.6，r=0.9999；大黃酚回歸方程為：A=53 988C-352.27，r=0.9999。結果表明，大黃素在0.40～10.00μg/ml范圍內呈良好的線性關系。大黃酚在0.80～20.00μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

精密度試驗：稱取樣品1份，按供試品溶液的制備項下方法制備，按上述色譜條件測定，連續重復進樣6次，測得大黃素峰面積RSD值為1.2%（n=6）；大黃酚峰面積RSD值為0.5%（n=6）。

重復性試驗：稱取同一樣品6份，按照供試品溶液制備項下方法制備，按上述色譜條件測定，并計算含量，結果大黃素和大黃酚的平均含量為0.035mg/粒，RSD=1.5%（n=6）。

穩定性試驗：稱取樣品1份，按照供試品溶液制備項下方法制備，按上述色譜條件測定，每隔2小時進樣1次，測得峰面積并計算，結果大黃素24小時內的RSD為1.4%（n=12），大黃酚24小時內的RSD為0.9%（n=12），結果表明樣品溶液在24小時內測定結果穩定。

回收率試驗：精密稱取已知含量的乙肝解毒膠囊內容物粉末6份，分別精密加入大黃素對照品溶液（0.01068mg/ml）6ml和大黃酚對照品溶液（0.0252mg/ml）7ml。按上述色譜條件測定，計算回收率。取3個批號的樣品，依照供試品溶液制備項下方法制備，按上述色譜條件測定。

大黃素在0.435～34.816μg/ml濃度范圍內峰面積積分值與濃度呈良好的線性關（r=0.9999）；大黃酚在0.963～77.056μg/ml濃度范圍內峰面積積分值與濃度呈良好的線性關系（r=0.9999），平均回收率為98.8%，RSD=0.8%(n=6)。

討 論

乙肝解毒膠囊是由關黃柏、重樓、黃芩、大黃、胡黃連、土茯苓、黑礬、綿馬貫眾8味中藥組成。清熱解毒，疏肝利膽，用于乙型肝炎辨證屬于肝膽濕熱內蘊者。其中大黃是該制劑的主要成分之一，大黃中主要成分為大黃素、大黃酚等。該制劑收載于衛生部藥品標準^[1]無含量測定方法。

檢測波長的選擇：分別取大黃素、大黃酚對照品的甲醇溶液，經島津UV-260型可見-紫外分光光度計，在220～470nm波長范圍內掃描，大黃素、大黃酚的最大吸收波長分別為253.8nm、255.2nm。根據大黃藥材含量的測定方法和對樣品實際測定情況，我們選擇測定波長為254nm。

流動相及柱溫的選擇：參考文獻用于分離大黃素、大黃酚的流動相主要有以下幾種，甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）。對以上的系統，采用柱溫40℃，流速1.0ml/分，逐一進行試驗，結果甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）為流動相對本方中大黃素和大黃酚及相鄰峰分離良好，分離度大于1.5。故選擇柱溫40℃，流速1.0ml/分，甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）為流動相。

提取方法的選擇：我們曾分別采用了以甲醇、乙醇為溶劑進行了提取溶劑的比較選擇，實驗結果證明，以甲醇為提取溶劑效果最佳。

在提取方法我們采用了超聲提取與加熱回流提取方法的比較。超聲儀為250W，50kHZ，超聲采用了超聲15、30、45分鐘提取，3個時間段的比較，結果超聲30分鐘提取效果好于超聲15分鐘，超聲45分鐘與超聲30分鐘無明顯差異。加熱回流采用了60分鐘提取，結果證明，超聲30分鐘效果好于加熱回流提取60分鐘。故文中采用以甲醇超聲30分鐘的提取方法。

本法具有樣品處理簡單，回收率好，重現性好，穩定性好，處方中其他成分對測定沒有干擾等優點，可以有效地控制該制劑的質量。

參考文獻

1 中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑.第1冊，2.

中國藥典.一部.2005年版，18-19.