反復(fù)下呼吸道患兒Ｔ細(xì)胞功能障礙及表型分析

關(guān)鍵詞 下呼吸道感染 T細(xì)胞 功能障礙 活化

資料與方法

38例反復(fù)下呼吸道患兒為本院兒科門診和住院患兒，依據(jù)衛(wèi)生部規(guī)劃教材兒科學(xué)第5版中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合反復(fù)呼吸道的診斷標(biāo)準(zhǔn)［１］。

排除哮喘、營(yíng)養(yǎng)不良及各種先天性的慢性心肺疾患。男27例，女11例，男：女=2.45:1。年齡1歲9個(gè)月~14歲7個(gè)月。納入病例均為出現(xiàn)RLRI 1年以上的患兒，最長(zhǎng)者達(dá)11年。

依據(jù)反復(fù)下呼吸道發(fā)生的次數(shù)，每年下呼吸道≥3次者為重型，17例；不足者為輕型，21例。對(duì)照組為20例健康兒童，男12例，女9例，年齡3~11歲，平均4歲2個(gè)月，所有對(duì)照組患兒均不符合反復(fù)下呼吸道感染的診斷。

收集反復(fù)下呼吸道患兒非感染期和健康對(duì)照組的肝素抗凝外周血3ml待測(cè)。

流式細(xì)胞儀分析：采用免疫熒光雙標(biāo)記單克隆抗體和流式細(xì)胞儀技術(shù)，分析病人及對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞表面標(biāo)志和活化及靜止淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)。

簡(jiǎn)述如下：于各測(cè)試管中加入100μl肝素抗凝血，再分別加入201μlFIFC／PE雙標(biāo)記單克隆抗體CD4／CD8、CD3／CD25、CD3／CD19、CD3／CD(16+56)、CD3／HLA-DR，室溫孵育20分鐘后，Q-Prep系統(tǒng)溶解紅細(xì)胞，2000r/分鐘離心5分鐘，祛除上清液后以PBS漂洗2次。以標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)整流式細(xì)胞儀，使變異系數(shù)<2％。上機(jī)檢測(cè)5000個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)放大。實(shí)驗(yàn)中所使用的FITC／PE雙標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自法國(guó)，EPICSXL型流式細(xì)胞儀為美國(guó)生產(chǎn)。

PBMC培養(yǎng)上清液中IL-4和IFN-γ水平的檢測(cè)：取肝素抗凝血2ml，常規(guī)分離出單個(gè)核細(xì)胞，在植物血凝素(100mg／L)刺激下培養(yǎng)72小時(shí)后離心保留上清液，-70℃保存待測(cè)。

ELISA方法檢測(cè)上清液中IL-4和IFN-γ的水平，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)。結(jié) 果

RLRI患兒T細(xì)胞表面分子表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果：重型患兒分別與輕型和對(duì)照組比較，T細(xì)胞表面CD3抗原表達(dá)率均明顯降低；而CD4抗原的表達(dá)在重型和輕型均較對(duì)照組顯著降低；CD8抗原表達(dá)率在各組間差異均無(wú)顯著意義。

CD3+／HLA-DR+為T細(xì)胞受抗原刺激后活化的標(biāo)志，本組患兒輕型和重型均較對(duì)照組顯著降低。

CD3+／CD25+為T細(xì)胞活化后IL-2R表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，該研究結(jié)果顯示重型RLRI患兒較輕型和對(duì)照組均明顯降低。

CD3+／HLA-DR為靜止T細(xì)胞的表面標(biāo)志，重型RLRI患兒的表達(dá)率較對(duì)照組明顯減低。

上述研究結(jié)果表明，RLRI患兒T細(xì)胞數(shù)量降低和T細(xì)胞活化功能障礙，尤其在重型RLRI的患兒更為顯著。

與Th1細(xì)胞功能有關(guān)的IL-2和IFN-r細(xì)胞因子水平的檢測(cè)RLRI患兒PBMC培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平，輕型和重型均較對(duì)照組顯著降低；重型較輕型IL-2水平也明顯降低。說(shuō)明RLRI患兒Thl細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子功能障礙。

B細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)率的檢測(cè)RLRI患兒重型和輕型分別與對(duì)照組比較，B細(xì)胞CDl9抗原表達(dá)率均明顯減低。NK細(xì)胞CD3-／CD(16+56)+的表達(dá)率在各組間的差異均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD3-／HLA-DR+為B細(xì)胞和NK細(xì)胞活化的標(biāo)志，其表達(dá)率在各組間差異亦不顯著。

討論

我們的研究結(jié)果顯示，RLRI患兒非感染期T細(xì)胞表面的多種免疫活性分子表達(dá)異常，表現(xiàn)為T細(xì)胞數(shù)量，尤其是CD4+細(xì)胞數(shù)減少，和T細(xì)胞活化功能障礙，重型患兒尤為顯著。

可能機(jī)制如下，①輔助T細(xì)胞數(shù)量降低或功能障礙，但其機(jī)制遠(yuǎn)未清楚。②T細(xì)胞活化的信號(hào)傳遞障礙。③T細(xì)胞活化過(guò)程中，活化的T細(xì)胞核因子功能障礙也不能調(diào)節(jié)正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)。但其確切的分子免疫機(jī)制需進(jìn)一步探討。

IL-2和IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)參與多種免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，Th1細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子刺激T、B細(xì)胞分化和CTL成熟，在機(jī)體清除病原微生物過(guò)程中有效的Th1反應(yīng)是不可缺少的。

在我們研究的病例中，IL-2和IFN-γ的分泌均較對(duì)照組明顯降低。推測(cè)RLRI患兒CD4+細(xì)胞數(shù)降低可能主要與Th1細(xì)胞數(shù)降低有關(guān)，考慮ThI細(xì)胞數(shù)量不足及功能障礙是RLRI患兒反復(fù)感染和病程遷延的主要原因之一。

抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化功能障礙及導(dǎo)致的細(xì)胞因子減少可引起B(yǎng)細(xì)胞的功能障礙。T細(xì)胞通過(guò)CD40及分子轉(zhuǎn)換機(jī)制在DNA水平對(duì)同種未定向B細(xì)胞起作用，并能夠支持定向B細(xì)胞抗體同種型轉(zhuǎn)換。IL-2是人類B細(xì)胞增殖和分化潛在的誘導(dǎo)劑，抗原刺激后IL-2產(chǎn)生降低能使患者B細(xì)胞功能異常。

另外，IFN-γ產(chǎn)生降低也可累及到B細(xì)胞的分化功能。因此，RLRI患兒外周血中B細(xì)胞CD19抗原表達(dá)率降低可能與T細(xì)胞數(shù)量減少及活化障礙有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

1 胡儀吉．反復(fù)呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)．中華兒科雜志.1988，26：41．