血平板紙片法分離嗜血桿菌的實(shí)驗(yàn)與評(píng)價(jià)

材料和方法

材料：①菌株：流感嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49766、ATC49274，由衛(wèi)生部生物制品檢定所提供；臨床分離2株流感嗜血桿菌，由衛(wèi)生部臨床試驗(yàn)中心提供；臨床流感嗜血桿菌19株和其他嗜血桿菌51株，均由本院臨床分離。②分離培養(yǎng)基：5%羊血肉液血瓊脂平板(牛肉湯，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%瓊脂和5%羊血，pH7.2)，VBC巧克力平板(制作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)^[1])，普通肉湯巧克力平板(牛肉湯，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%瓊脂消毒后，80℃時(shí)加5%羊血制成巧克力平板，pH 7.2)。

方法：①細(xì)菌鑒定：可疑菌落同時(shí)接種于血平板和M-H平板上進(jìn)行衛(wèi)星試驗(yàn)，補(bǔ)步鑒定流感嗜血桿菌和其他嗜血桿菌，用PAINH嗜血桿菌鑒定板(梅里埃公司產(chǎn)品)進(jìn)行最終鑒定。②分離嗜血桿菌紙片的研制：通過(guò)觀察比較各成分不同濃度對(duì)嗜血桿菌的影響，確定紙片含各種成分的最終濃度(含萬(wàn)古霉素45μg，桿菌肽300μg，輔酶1700μg和酵母粉150μg)。干燥后，30℃保存?zhèn)溆谩?duì)不同紙片的形狀進(jìn)行觀察和比較后，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)條狀紙片優(yōu)于圓形紙片。它可同時(shí)貼于劃線(xiàn)平板的不同區(qū)域，即從原始劃線(xiàn)處到分出單個(gè)菌落處，這樣有利于提高嗜血桿菌的分離率，其最終大小為25mm×4mm。③紙片法分離各種嗜血桿菌的操作方法：將各種欲分離嗜血桿菌的標(biāo)本，如痰、生殖系統(tǒng)拭子和腦脊液等標(biāo)本，用常規(guī)方法接種于營(yíng)養(yǎng)豐富的血平板上，將分離嗜血桿菌紙條一端貼于原始劃線(xiàn)處，另一端貼向低濃度劃線(xiàn)區(qū)(采用三區(qū)劃線(xiàn)法時(shí)，紙條從一區(qū)向二、三區(qū)方向貼)放入CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，第2天觀察結(jié)果，選擇紙片周?chē)L(zhǎng)而遠(yuǎn)離紙片不能生長(zhǎng)的菌落。嗜血桿菌菌落多細(xì)小、透明、光滑，一些菌株較濕潤(rùn)，同時(shí)注意細(xì)菌的溶血情況。然后用血平板和M-H平板衛(wèi)星試驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定。如果24小時(shí)觀察難或細(xì)菌生長(zhǎng)不良，需48小時(shí)后繼續(xù)觀察。④模擬陽(yáng)性標(biāo)本的配制：將上述流感嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49766、ATCC49274，臨床分離的2株流感嗜血桿菌，分別制成0.5個(gè)麥?zhǔn)瞎軡舛鹊木鷳乙海考尤胧妊獥U菌陰性痰標(biāo)本中(痰標(biāo)本經(jīng)VBC巧克力平板培養(yǎng)鑒定為陰性)，制成流感嗜血桿菌不同濃度的模擬陽(yáng)性標(biāo)本。

紙條不同成分對(duì)嗜血桿菌生長(zhǎng)的影響：制備3種紙條，紙條一含萬(wàn)古霉素45μg，桿菌肽300μg，輔酶粉150μg；紙條二含輔酶粉1700μg；紙條三含萬(wàn)古霉素45μg，桿菌肽300μg，酵母粉250μg。將流感嗜血桿菌同時(shí)接種血平板和M-H平板上，3種紙條分別貼在表面，37℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24小時(shí)，觀察3種紙條周?chē)鞲惺妊獥U菌生長(zhǎng)情況。在血平板上，紙條一周?chē)蟹浅Ｐ〉囊志h(huán)，在抑菌環(huán)外有大量流感嗜血桿菌生長(zhǎng)環(huán)；紙條二周?chē)辛鞲惺妊獥U菌生長(zhǎng)環(huán)；紙條三周?chē)鸁o(wú)流感嗜血桿菌生長(zhǎng)。M-H平板上，3種紙條均無(wú)流感嗜血桿菌生長(zhǎng)。

流感嗜血桿菌在3種培養(yǎng)方法上的生長(zhǎng)情況比較：對(duì)傳統(tǒng)的巧克力平板法、VBC巧克力平板法和自建的血平板紙片法流感嗜血桿菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。以其在傳統(tǒng)的巧克力平板上每cm2形成的菌落數(shù)為100%進(jìn)行比較，觀察單位內(nèi)菌落數(shù)和菌落大小。其中傳統(tǒng)的巧克力平板上單位菌落數(shù)為100%，菌落較大，約為1.5mm；VBC巧克力平板上單位菌落數(shù)為92.4%，菌落較傳統(tǒng)巧克力平板的菌落略小，約1.2mm；在血平板紙片法上，其菌落的多少和大小均隨紙片間的不同距離而變化，在菌落生長(zhǎng)較好的區(qū)域，其單位菌落數(shù)為其95.6%，菌落大小約為1.2mm。

比較不同培養(yǎng)方法對(duì)模擬流感嗜血桿菌陽(yáng)性痰標(biāo)本的分離情況：用傳統(tǒng)的巧克力平板法、VBC巧克力平板法、自建的平板紙片法和血平板上金葡菌劃線(xiàn)法，對(duì)100株不同濃度的模擬流感嗜血桿菌陽(yáng)性痰標(biāo)本和50株嗜血桿菌陰性痰標(biāo)本進(jìn)行分離比較。

結(jié) 果

100株模擬陽(yáng)性痰標(biāo)本，4種方法的分離率分別為64%、76%、84%和28%。巧克力平板法與VBC巧克力平板法進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)，結(jié)果X2=7.56，P<0.01，其結(jié)果差異有顯著性。巧克力平板法與血平板紙片法進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)結(jié)果X2=16.3，P<0.01，其結(jié)果要差異也有顯著性。

臨床痰標(biāo)本分離嗜血桿菌比較：用VBC巧克力平板法和自建平板紙片法對(duì)我院呼吸內(nèi)科患者162份痰標(biāo)本同時(shí)配對(duì)進(jìn)行分離培養(yǎng)，后對(duì)79份痰標(biāo)本用自建的血平板紙片進(jìn)行分離培養(yǎng)，其中VBC巧克力平板法分離痰標(biāo)本162份，分離流感嗜血桿菌7株(分離率4.3%)，其他嗜血桿菌18株，血平板紙片法分離痰標(biāo)本241份，分離流感嗜血桿菌12株(分離率4.98%)，其他嗜血桿菌33株。進(jìn)行卡方檢驗(yàn)后，其結(jié)果X2= 0.9，P<0.05，結(jié)果無(wú)差異。

討 論

提高嗜血桿菌分離率是目前亟需解決的問(wèn)題。由于各種原因，實(shí)驗(yàn)往往忽略嗜血桿菌的培養(yǎng)。從流感嗜血桿標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌液在各培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況看，傳統(tǒng)的巧克力平板上生長(zhǎng)情況更佳，而VBC巧克力平板和紙片法血平板上生長(zhǎng)相似，后者可能與抗生素的加入有關(guān)。但在有正常菌群影響的情況下，傳統(tǒng)巧克力平板就不能很好地分離嗜血桿菌，通過(guò)對(duì)150份模擬痰標(biāo)本的臨床標(biāo)本的檢測(cè)說(shuō)明，在有正常菌群的情況下，采用加入抗生素的方法，VBC法和紙片法較不加抗生素的方法效果好，這同國(guó)內(nèi)外的報(bào)道相似。在血平板上用紙片法分離嗜血桿菌屬，操作簡(jiǎn)單，不需要增加更多的培養(yǎng)基，減輕了接種的工作量，但陽(yáng)性菌落尚需用衛(wèi)星試驗(yàn)或Ⅹ、Ⅴ因子試驗(yàn)鑒別到種，即區(qū)別流感嗜血桿菌和其他嗜血桿菌各種。

參考文獻(xiàn)

1 Chapin KC，Doem VG.Selecive media for recovery of Haemophilus influenzae from specimens contaminated with upper respiratory tract microbial flora.J Clin Micro-biol，1983，17：1163-1165.

2 公允，何永山，崔月花.流感嗜血桿菌培養(yǎng)基地的研究.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1996，19：105-105.

3 項(xiàng)明潔，江勇，徐蓉，等.兩種培養(yǎng)基對(duì)嗜血桿菌屬分離鑒定的比較，中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1997，20：32-34.