免疫分析技術研究進展

摘 要：目的：綜述免疫分析技術的最新研究進展。方法：通過查閱國內外有關免疫分析技術的研究論文，對放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、化學發光免疫分析(CLIA)等免疫分析技術進行了綜述，同時指出了發展前景和尚待解決的問題。結果：多種免疫分析方法相互結合，可大大提高分析方法的靈敏度，增大檢測范圍；CLIA和TRFIA是非放射免疫分析的兩大主流，其中，CLIA更具有競爭力。結論：目前還沒有一種免疫分析技術是完美無缺的，各種技術還需要不斷發展和完善，以開發出更新、更理想的免疫分析技術。

關鍵詞：藥物分析學；免疫分析；放射免疫分析；酶免疫分析；熒光免疫分析；化學發光免疫分析

中圖分類號：R392-33 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2007)10-033-04

免疫分析法(immunoassay ，IA)是基于抗原和抗體特征性反應的一種技術。由于免疫分析試劑在免疫反應中所體現出的獨特的選擇性和極低的檢測限，使這種分析手段在臨床、生物制藥和環境化學等領域得到廣泛應用。各種標記技術(放射性標記、熒光標記、化學發光、酶標記等)的發展，使免疫分析的選擇性更加突出。免疫分析法起始于本世紀50年代，首先應用于體液大分子物質的分析，1960年，美國學者Yalow和Berson等將放射性同位素示蹤技術和免疫反應結合起來測定糖尿病人血漿中的胰島素濃度，開創了放射免疫分析方法的先河。1968年，Oliver將地高辛同牛血清白蛋白結合，使之成為人工抗原，免疫動物后成功獲得了抗地高辛抗體，從而開辟了用免疫分析法測定小分子藥物的新領域。在RIA的基礎上，隨著新的標記物質的發現及新的標記方法的使用，以及電子計算機、自動控制技術的廣泛應用，派生出許多新的檢測技術^[1]，使免疫分析法逐漸發展成為一門新型的獨立學科。

1 免疫分析方法分類

(1)根據標記物的不同，可以免疫分析主要分為放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫分析(enzyme immuoassay，EIA)、化學發光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)等。

(2)按反應機制的不同，可以分為競爭法和非競爭法。非競爭法是將待測抗原與足夠的標記抗體充分反應形成抗原-標記抗體復合物，產生的信號強度與抗原的量成正比。競爭法是將過量的待測抗原與定量標記抗原競爭結合形成定量的特異性抗體，待測抗原的量越大，與抗體結合的標記抗原量越少，產生的信號強度越小，由此定量待測抗原的量。

(3)還可以按測定過程中的某些步驟的差異分為均相免疫分析和非均相免疫分析兩大類。均相酶免疫測定法的特點是抗原-抗體反應達到平衡，對結合與游離的標記物無需進行分離，可在自動生化分析儀器上直接測定。非均相酶兔疫測定法的特點是必須對結合和游離的標記物進行分離，才能測定各自的濃度。

2 放射免疫分析(RIA)

放射免疫分析是以放射性同位素為示蹤物，與免疫反應相結合的一種分析方法，提供的檢測信號是不斷發出的放射線。常用來標記的放射性同位素有3H、14C、1251、1311等。

放射免疫分析在應用上的優點是準確靈敏、特異性強，儀器試劑價格低廉、技術成熟，在我國仍將在相當長一段時間內被應用、推廣和發展。然而，其在應用上的缺點也是顯而易見的，如藥盒的使用壽命短，批間、批內變異較大，雖涉及放射性微小，但仍會面臨公眾反核的負面影響。此外，放射免疫分析較難進行自動化分析，將面臨新一代更靈敏、穩定、快速而且自動化程度高的測量技術的挑戰。

3 酶免疫分析(EIA)

酶免疫分析是一種非放射性標記免疫分析技術，以酶標記抗原或抗體作為示蹤物，由高活性的酶催化底物顯色或發光，達到定量分析的目的。最初應用的EIA技術，多采用HRP標記抗體或抗原，靈敏度不高。后來逐步發展了各種放大體系，如底物循環放大體系、酶聯級放大體系、生物素-親和素放大體系、脂質體或紅細胞等作為標記物載體以包載大量標記物的放大體系，以及采用PCR技術的PCR-EIA分析，使靈敏度有很大改進。

3.1 生物素-鏈親和素酶免分析(biotin avidin sys-temBAS-EIA)

生物素(botin)廣泛存在于動植物組織中，在生物體內是羧化酶的輔酶；親合素又名抗生物素蛋白，與生物素具有高度的親和性，利用這一點，以生物素和親和素為中介，可增強抗原-抗體反應的結合提高檢測方法的靈敏度。但親和素的非特異性結合高，后又發現另一種親合素，稱之為鏈親合素(Streptavin，SA)，克服了親合素非特異性結合高的缺點^[2]。免疫分析技術中，目前均采用SA供標記酶或其它示蹤劑。一個完整的SA分子上的4個相同亞基，都可以和一個生物素分子結合，其Ka值達1015L/mo1，是抗體抗原反應的10～100萬倍。又加之一個抗體或抗原分子結合多個生物素分子，不改變其免疫活性。

BAS-EIA的基本模式是以SA和酶的結合物作酶標記物，借助生物素、親和素的高親和力達到放大的目的，目前主要采用BSA-多層夾心法^[3]：固相抗體-待測樣品-生物素化抗體-鏈親合素辣根過氧化物酶(SA-HRP)結合物；BSA-固相抗體競爭法^[4]：固相抗體-抗原(生物素化抗原)-(SA-HRP)；BSA-固相抗原競爭法：固相抗原(樣品抗原)-生物素化抗體-(SA-HRP)；BSA-固相二抗競爭法：固相抗抗體-抗體-生物素化抗原-(SA-HRP)。

3.2 脂質體免疫分析法(liposome immunoassay LIA)

脂質體是一種生物摸擬膜，它是磷脂分子分散于水相介質中形成的密閉的雙子單層或多層的囊泡。其膜內可包容上萬個標記物分子，具有很高的信號放大作用。因此，將脂質體用于免疫分析是提高非放射免疫分析靈敏度的有效途徑之一，由此所建立起來的方法即為脂質體免疫分析法。

3.2.1 LIA的分類

LIA的測定模式主要有補體介導法、細胞膜溶解素介導法、凝集法和六角相變法。

補體介導法是依賴于補體的脂質體免疫的分析法，利用脂質體膜表面抗原抗體反應激活補體使脂質體溶解。補體介導法的優點是均相、快速、靈敏、樣品用量少及可實現自動化，既可以測定小分子的半抗原^[5]，又可以測定大分子的蛋白或抗體^[6，7]。其不足在于測定結果受脂質體膜表面形成的抗原-抗體復合物的數目、抗體的親和力以及補體的活性等影響較大；參與經典途徑激活的補體成分較多且不穩定，其中任何一個失活，都將導致脂質體溶解的減少或失敗；所使用的補體活性有差異，每一批新的補體在使用之前都需測定其理想的濃度或稀釋度。

細胞膜溶解素介導法是依據細胞膜溶解素及其與半抗原(或半抗原類似物)的復合物使脂質體膜溶解并釋放出內含的標記物，而相應的游離抗體則抑制它的溶解建立起來的分析方法。該方法具有通用性，一種脂質體的制備可用于不同分析物的測定，并且脂質體不致敏，避免了使用易變的補體，整個試驗快速，可在5～10min內完成。不過，該測定模式的敏感性受抗體的親和力及半抗原-細胞膜溶解康的復合物的溶解活性影響較大。

六角相變法是依據某些磷脂如磷脂酰乙醇氨或心磷酯在一定條件下可分別形成脂質體和極不穩定的六角形相II(Hexagona，HII，)兩種結構，且兩者可以發生相變的性質，建立LIA，統稱為六角相變法。又可分為二價陽離子非雙層構型誘導抑制法、靶敏感免疫脂質體測定法、接觸敏感的脂質體免疫分析法^[8]。

3.2.2 LIA的標記物及信號測量

LIA應用研究的早期，人們以順磁分于做標記物^[9]，采用電子自旋共振技術測量信號。這種檢測體系安全而靈敏，但儀器昂貴，而且實驗中還必需避免自旋信號為生物液所猝滅。

用天然酶如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GOD)^[10]等作標記物，優勢在于信號可以用分光光度計測量，利于LIA的普及和推廣；天然酶不會從脂質體中滲漏出來，從而保證了低的檢測背景；脂質體和酶的雙重放大作用使體系具有更高的靈敏度。缺點是該體系脂質體溶解后不能直接進行信號測量，而必須先進行酶與底物的反應；脂質體制備期間，酶不可避免地會部分失活。

用熒光分子如羧基熒光素(CF)、鈣黃綠素等作標記物，則脂質體溶解后無需進一步的反應，可直接用熒光分光光度計測量信號，此外，這類標記物以高濃度包裹在胎質體內時發生熒光自摔滅作用，從而保證了低的檢閱背景和高的檢閱靈敏度。但熒光分子體積太小，能夠從脂雙層中滲漏出來，另外，Stokes位移小于50 nm的熒光物質還存在著光散射的影響。

3.3 PCR-EIA分析

PCR-EIA技術是運用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應的特異性，它以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接的DNA，由PCR產物的量來反映抗原分子的量。由于PCR的高擴增能力，只需數百個抗原分子即可檢測，甚至在理論上可檢測到一至數個抗原分子。

3.3.1 PCR-EIA模式

最初Sano等建立的免疫PCR模式為：固定化抗原-抗體-蛋白Ao鏈親和素-生物素oPUC19，可以檢測到600個BSA抗原，比用堿性磷酸酶作為標記物的ELISA敏感度高106。雖然這種方法有極高的靈敏度，但所用的連接分子鏈親和素-蛋白A嵌合體還沒有商品化，限制了它在實際應用中的廣泛普及。Ruzicka^[11]等人以生物素化的抗體取代Sano PCR-EIA系統中的抗體，采用固定化抗原-抗體o鏈親和素-生物素oPUC19模式。這種方法不需要特殊的試劑，生物素和親和素(鏈親和素)都已經商品化，因此在實際操作中得到廣泛應用^[12]。

3.3.2 PCR擴增產物的檢測

一般是通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色來檢測并定量的，也有在凝膠電泳后用Southern雜交來檢測PCR產物^[13，14]。1997年，Niemeyer^[15]提出所謂免疫PCR和PCR-ELISA檢測并定量PCR產物。它主要是用一對分別標記生物素和地高辛的引物來擴增標記DNA，以親和素作為捕獲抗體固定擴增產物，用標記上堿性磷酸酶的抗地高辛抗體進行雙抗夾心ELISA，即固相親和素-生物素oDNAo地高辛-抗體o堿性磷酸酶，使結果具有更高的穩定性和可重復性。

4 熒光免疫分析(FIA)

FIA是以熒光物質標記抗原或抗體，形成的標記物發生免疫反應后，引起熒光強度發生變化，從而達到定量分析的目的。熒光免疫分析的方法很多，如熒光偏振免疫分析(fluroescence polaruzation immunoassay PFIA)、熒光猝滅免疫分析(fluorescemt enchancement immumoassay)、熒光增強免疫分析(Flurorescent Enhancement Immunoassay FEIA)。

傳統熒光免疫分析受到散射光、樣品的背景熒光和熒光淬滅等因素的干擾，分析靈敏度較低。而時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay TRFIA)彌補了這一缺陷。其原理是應用鑭系元素結合有機配體形成三價離子態時，在特定波長的紫外線激發下，從基態躍遷到高能態，經200us的固定時間延遲，返回基態時發射特定熒光。由于時間延遲以及激發光與發射光的頻移，有效地屏蔽了由血清等生物物質產生的熒光，降低了本底，與RIA和EIA相比，TRFIA具有更好的特異性和精密度^[16，17]。

時間分辨熒光免疫分析方法根據不同的激發源及分析體系，現有三種分析體系。一類以芬蘭Wallac-ABCU8為代表。這類免疫分析方法中，免疫結合物鑭系離子必須在酸性的增強液內解離出來，并與另一種螯合劑結合，達到增強熒光的作用，稱為解離增強瀾系熒光免疫分析(DE-LFIA)；另一類以加拿大Cyberfluor系統為代表，采用BCPDA為螯合劑，引入生物素-鏈親合素系統以提高靈敏度，直接進行固相測量；還有一類以美國Packard-HTBF微板系統為代表，配合特殊替合劑，可進行均相法檢測。

目前，正在發展的TRFIA技術有：應用多標記、共包被等技術實現多個待測物同時檢測；研制具有足夠絡合穩定性、良好的親和性和優良的可檢測性的配基作為標記物，以克服易受外源性污染影響的缺陷；選擇活性基團密度高的載體實現多重標記以提高分析靈敏度；以及熒光極化的均相免疫分析技術等。

5 化學發光免疫分析(CLIA)

化學發光免疫分析是將高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，借以檢測抗原或抗體的分析技術。它包含化學發光反應與免疫反應兩個部分。化學發光反應是利用某些特定的化學反應所產生的能量使其產物或反應中間態分子激發，形成電子激發態分子，當這種激發態分子回到穩定的基態時，所釋放的能量以可見光形式發射。

直接化學發光物質標記法常用的發光標記物是吖啶酯和吖啶酰胺類，將其直接標記于抗原或抗體，通過啟動發光試劑(NaOH-H2O2)即可發出快速的閃爍光；化學發光酶免分析是將EIA與CL結合起來，以化學發光物質作為酶底物，在酶的催化放大和啟動發光試劑的共同作用下發光。常用的的化學發光物為魯米諾、異魯米諾及其衍生物類、(金鋼烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物類，為提高靈敏度，還可以加入發光增強劑，如3-氯-4-羥基-乙基苯胺。

60年代以來，逐步發展為電化學發光免疫分析。文獻報道了很多物質的電化學發光，最常見的是利用稀土元素“釕”進行標記，磁顆粒作B/F分離及電極上的氧化還原反應來進行分析，測定結果十分穩定。近10年來CLIA發展迅猛，是目前發展和推廣應用最快的免疫分析方法之一，尤其是ECLIA。它具有實現均相測量和多元檢測等獨特的優點，同時化學發光儀已發展為全自動化，全部工作由計算機控制，即從加樣、傳輸、溫育、分離、洗滌和測量到數據處理和結果打印，全部實行自動化。

以上介紹了多種免疫分析方法，它們之間還可相互結合、互相補充，如將EIA與熒光技術或化學發光技術結合，形成熒光酶免疫分析(FEIA)及化學發光酶免疫分析(CLEIA)，從而大大提高靈敏度，增大檢測范圍。CLIA和TRFIA是非放免分析的兩大主流，但從發展速度和市場應用推廣來看，CLIA更具有競爭力。但不管怎樣，目前還沒有一種免疫分析技術是完美無缺的，因此，各種技術還需要不斷發展和完善。人們正在不斷研究，以開發出更新、更理想的免疫分析技術。

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