鹿茸多肽對兔骨性關節炎軟骨細胞金屬蛋白酶ｍＲＮＡ表達的影響

摘 要 目的：在家兔膝關節骨性關節炎模型的基礎上觀察鹿茸多肽對骨性關節炎軟骨細胞的影響。方法：隨機分成兩組，實驗組建立Hulth骨性關節炎模型，對照組僅行雙側膝關節切開術，以建立模型。以正常新西蘭大白兔膝關節軟骨為正常對照組，以鹿茸多肽為實驗藥，法滋隆為陽性對照藥。分別進行MTT法檢測、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測及瓊脂糖電泳檢測，獲取前后軟骨細胞核酸中金屬蛋白酶表達情況。結果：鹿茸多肽對骨性關節炎軟骨細胞具有促進增殖作用；骨性節炎軟骨細胞直接分泌到胞外的金屬蛋白酶含量變化不明顯；骨性關節炎軟骨細胞核酸中金屬蛋白酶出現高表達。結論：骨性關節炎軟骨細胞在軟骨細胞正常分化及增殖發生改變的過程中，骨性關節炎軟骨基質降解可能是金屬蛋白酶與其他因子協同作用的結果；鹿茸多肽可促進骨性關節炎軟骨細胞增殖，并可抑制骨性關節炎軟骨細胞中金屬蛋白酶的過度表達，可能對治療骨性關節炎有較好的作用。

關鍵詞 骨性關節炎 金屬蛋白酶 軟骨細胞

試劑、儀器及實驗材料 

主要試劑：①化學試劑：碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、考馬斯亮蘭、MTT、甘氨酸、Tris、SDS、TEMED、二甲基亞砜。②細胞培養試劑與培養板。③聚合酶鏈式反應（PCR）試劑：RNA提取試劑盒，RNA PCR相關試劑盒。主要儀器：（略）

實驗材料：新西蘭大白兔，鹿茸多肽，骨肽注射液。

實驗方法

動物模型及分組：雄性新西蘭白兔8只，3～5個月齡，體重2.5～3.5kg，平均2.85kg。按組間均衡一致的原則隨機分為兩組，每組4只。采用內側副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內側半月板Hulth骨性關節炎模型，實驗組均行內側副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內側半月板；對照組僅行側膝關節切開術，但不行前交叉韌帶切斷并切除內側半月板術。

MTT法檢測鹿茸多肽對軟骨細胞生長的影響，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，RT-PCR法檢測軟骨細胞中金屬蛋白酶mRNA表達。

統計學方法：均值間差異比較采用組間t檢驗，數據統計以（X[TX-]±S）表示。

結果與分析

鹿茸多肽對兔骨關節炎軟骨細胞增殖的影響：10μg/ml、50μg/ml的鹿茸多肽均不影響軟骨細胞的活性，而在72小時內100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml的鹿茸多肽對軟骨細胞的增殖均有促進作用，與對照組有顯著性差異（P<0.05、P<0.01）。依據實驗原則（用量最小，療效最好），判定100μg/ml為促進軟骨細胞增殖的最佳藥物作用濃度。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測軟骨細胞分泌金屬蛋白酶：金屬蛋白酶1、3在正常、骨性關節炎軟骨細胞及不同濃度鹿茸多肽作用軟骨細胞分泌的胞外基質中未見異常表達。

RT-PCR法檢測軟骨細胞中金屬蛋白酶mRNA表達實驗結果：金屬蛋白酶1、3在正常軟骨細胞核酸中未見明顯表達，而在骨性關節炎軟骨細胞中其含量卻出現高表達，并且在經鹿茸多肽、法滋隆作用后的骨性關節炎軟骨細胞核酸中未見金屬蛋白酶1、3表達。

討 論

骨性關節炎中關節軟骨進行性破壞和喪失的機制還不清楚，但其病理過程可劃分為三個相互交叉的階段，即軟骨基質的改變，軟骨細胞對組織損傷的改變，軟骨細胞合成代謝衰退及軟骨組織的進行性喪失［1］。可見，軟骨細胞作為關節軟骨中惟一一種細胞，其功能決定著骨性關節炎的轉歸，軟骨細胞功能的異常是骨性關節炎變化的開始和關鍵［2］。軟骨細胞發生損傷后，受損的軟骨細胞發生變性，使軟骨細胞細胞周期發生變化，細胞內合成調控機制發生改變，使正常軟骨細胞代謝發生改變，增生修復與降解出現紊亂，最終導致骨性關節炎的發生。

鹿茸多肽對軟骨細胞生長的影響［3］：本實驗研究發現，低劑量鹿茸多肽促進軟骨細胞增殖的作用并不明顯，中、高劑量鹿茸多肽對骨性關節炎軟骨細胞具有顯著促進作用。

鹿茸多肽作用前后軟骨細胞分泌到胞外基質及胞內產生的金屬蛋白酶表達的比較：本實驗發現，金屬蛋白酶1、3在正常及骨性關節炎軟骨細胞和鹿茸多肽作用后正常及骨性關節炎軟骨細胞分泌的胞外基質中，均未見異常表達；而在骨性關節炎軟骨細胞核酸中，金屬蛋白酶1、3均出現高表達，并且在鹿茸多肽及法滋隆作用后骨性關節炎軟骨細胞核酸中，金屬蛋白酶1、3均受到明顯抑制。出現此種現象的原因可能為：金屬蛋白酶胞外分泌的含量低，或被金屬蛋白酶抑制劑-1結合；缺乏細胞因子或生長因子的協同作用，細胞因子及生長因子對軟骨細胞分泌功能及增殖的調節，是成熟個體軟骨發育及維持內環境穩定的關鍵。根據細胞外刺激的不同，軟骨細胞可被誘導，分別進行異化基質降解或同化基質形成的功能過程。

本研究提示，鹿茸多肽對兔骨性關節炎軟骨細胞具有促進增殖作用，兔骨性關節炎軟骨細胞直接分泌到胞外的金屬蛋白酶（MMP-1、3）含量無差異，金屬蛋白酶（MMP-1、3）在兔骨性關節炎軟骨細胞核酸中高表達。可以推斷，骨性關節炎軟骨細胞細胞周期及細胞功能均發生改變，金屬蛋白酶對骨性關節炎軟骨基質的降解作用，可能是與骨性關節炎發病相關的細胞因子協同作用的結果；鹿茸多肽可能通過軟骨細胞細胞核酸的金屬蛋白酶的表達，進而調整病理性軟骨細胞功能，使病理性軟骨細胞向正常軟骨細胞轉化。

參考文獻

1 鄭召民，陳清漢.骨性關節炎血流動力學及代謝研究的現狀和未來.河南醫學研究，1994，3（2）：188-192.

2 J Bryan.Studies on donal cartilage strains Ⅱ selective effects of diffeveuf growth comditions.Experimental Cell Reseach，1988，52：327-337.

3 翁樑，周秋麗，王麗娟，等.鹿茸多肽促進表皮合成纖維細胞增殖及皮膚創傷愈合.藥理學報，2001，36（11）：817-820.