蟲生真菌蟬擬青霉及其角變株的比較研究

摘要 蟬擬青霉GZUIFR-JZD3菌株在沙氏培養基上可產生孢子型(JZD3-c)和菌絲型(JZD3-M)兩類不同的角變。為了進一步研究其差異，筆者比較了兩個角變株與原始菌株(JZD3)在不同培養基上的生長及產孢量。研究了其對甘藍蚜的致病性并測定了它們的胞外多糖、蛋白酶、蛋白質、SOD和POD的含量。結果表明：3個菌株形態差異較大，在多數培養基上，JZD3生長最快，產孢量最大；胞外多糖、SOD、POD含量以及對蚜蟲致病率也是JZD3菌株最佳；而蛋白酶和蛋白質含量則分別是JZD3-C和JZD3-M較高。

關鍵詞 蟬擬青霉；角變；多糖；酶；致病性

中圖分類號 S476.12

蟬擬青霉[paecilomyces cicadae(Miquel)Samson]為麥角菌科真菌大蟬草(Cordyceps cica-dae Shing)的無性型，它寄生山蟬(Cicada flam-mata Dist)形成的蟲菌復合體俗稱蟬花。蟬花藥用已有1000多年的歷史。《本草綱目》記載蟬花性寒味甘，具散風熱、定驚鎮痙等功效，無毒，功能同蟬蛻。現代醫學研究表明其具有免疫調節，改善機體營養狀況、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等作用。蟬擬青霉與冬蟲夏草具有相似的活性成分，具有相似的藥用價值。蟬擬青霉也是病原性較強的蟲生真菌，有人對菜青蟲進行了田間試驗，取得了很好的防治效果。蟬擬青霉對小菜蛾的致死率可達72.4％～93.5％對菜粉蝶也有較強的致病性。蟬擬青霉作為生防制劑還有一個優點，此菌可在一些自然基物上培養，能形成大量分生孢子，室溫下貯存一年不失活性。蟬擬青霉具有豐富的形態多樣性，能形成異核體。異核體在真菌內，尤其在半知菌內極為普遍，它具有雜交優勢，而且能夠攜帶隱性基因。作者在培養一株蟬擬青霉GZUIFR-JZD3過程中觀察到兩種表型差異較大的扇形角變，本文將報道研究這兩個角變菌株和原始菌株在不同培養基上的培養特性、對蚜蟲的致病性、胞外多糖、SOD、POD等生物活性物質含量的差異。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源

蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson]由韓國延世大學金容煜博士提供。菌株保存于貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，編號為GZUIFR-JZD3。

1．1．2 試蟲來源

甘藍蚜[Brevicoryne brassicae(Linnaeus)]來自貴州省農業科學院植保系。

1．1．3 培養基

沙氏培養基(Sabouraud)：葡萄糖20 g，麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，水補足1 000 mL。去瓊脂即為液體培養基。121℃滅菌30 min備用。去瓊脂為液體培養基。

查氏培養基(Cazpek)：NaN03 2 g；蔗糖30 g；K₂ HPO₄ 1 g；KCl 0.5 g；MgSO₄·7H₂O 0.5 g；FeSO₄·7H₂O 0.01 g；瓊脂20 g；蒸餾水補足至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min備用。

在查氏培養基中分別加0.01％、0.05％、0.1％蛋白胨備用。

蛋白酶誘發培養基：NaCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3 g，明膠1％，pH7.0，0.02 mol/L磷酸鉀緩沖液定容至1 000 mL。

1．2 方法

1．2．1 菌落角變觀察及產孢結構的觀察

將保存于冰箱中的菌種點種到沙氏培養基培養皿上，26℃下培養。幾天后，分離兩角變菌株，將原菌株、孢子型角變菌株、菌絲型角變菌株分別編號為：JZD3、JZD3-C、JZD3-M。反復接種，觀察其穩定性。

1．2．2 5種培養基上的菌落培養性狀

分別將以上3個菌株點種在沙氏、查氏、查氏+0.01 9/6蛋白胨、查氏+0.05％蛋白胨、查氏+0.1％蛋白胨平板上，26℃下培養14 d，觀察記錄其生長速度、菌落特征等。每個菌每平板設3個重復，取平均值。

1．2．3 5種培養基平板上的產孢量測定

將菌株JZD3、JZD3-C、JZD3-M接種到以上5種培養基的試管斜面中(所有試管斜面的培養基體積都是4 mL，斜面面積相等)，26℃下培養10 d，測產孢量時每管加5 mL 0.05％吐溫-80，洗下斜面上的所有孢子，一層擦鏡紙過濾掉菌絲，血球計數板計算孢子量。

1．2．4 生化測定方法

1．2．4．1 胞外多糖測定方法

0.05％吐溫-80洗下各試管內孢子，無菌水稀釋至孢子濃度為5.0×10⁷個/mL，在事先準備好的沙氏液體發酵培養基中接入2 mL的孢子液。26℃，120 r/min培養4 d。濾紙過濾菌絲球，4 000 r/min離心5 min，上清液即為多糖待測液。蒽酮法測定。每菌設3瓶發酵液，每瓶發酵液測3次。

1．2．4．2 蛋白酶測定方法

將上述多糖測定方法中的培養基改為蛋白酶誘導培養基。國標法測定(ZB X 66030-87)。

1．2．4．3 蛋白質測定方法

分別將試管內的蟬擬青霉孢子制成濃度為5.0×10⁷個/mL的孢子懸液，取0.2 mL至500 mL三角瓶內(100 mL沙氏液體培養基)。26℃，120 r/min培養5 d。取出過濾，晾干菌絲球，取一定質量的菌絲球置于預冷的玻璃勻漿器內，加5 mLpH7.8的磷酸緩沖液磨成勻漿，過濾離心，上清液即為蛋白質待測液。考馬斯亮藍G250法測定。

1．2．4．4 SOD測定方法

上述蛋白質粗提液也是SOD待測液。氮藍四唑法測定。

1．2．4．5 POD測定方法

上述蛋白質測定方法中，pH7.8磷酸緩沖液改成pH6.5磷酸緩沖液所得上清液即為POD待測液。愈創木酚法測定。

1．2．5 對蚜蟲的致病性測定方法

吐溫水洗下試管內(培養基為查氏+0 .05％蛋白胨)的孢子，制成濃度大約為5.0×10⁷個/mL的孢子懸液，取干凈的新鮮甘藍葉片，葉片在孢子液中浸泡大約3 min，取出瀝干，放入墊有濾紙的大培養皿蓋內，葉柄處棉球保濕。用毛筆將試蟲輕輕放在葉片上，蓋上培養皿。另外，設置空白對照，即孢子懸液換成相同濃度的吐溫水。每天觀察并記錄蟲的死亡情況。本試驗中采用觀察到蟲尸上長出感染菌的白色菌絲即認為被蟬擬青霉感染。設3個重復，每個重復40～50頭，取其平均值，感染數等于孢子處理皿感染數減去只用吐溫水處理的對照自然死亡數。

2 結果

2．1 形態特征觀察

2．1．1 菌落角變及產孢結構的觀察分離并觀察其

產孢結構

點種在沙氏平板上的3個菌株，幾天后發現，JZD3出現孢子型(JZD3-C)和菌絲型(JZD3-M)兩類不同的角變。JZD3-C菌絲稀疏，大量產孢，菌落比原菌株薄；JZD3-M菌絲生長濃密，產孢較少，菌落明顯比原菌株厚(圖1 A)。若繼續培養，JZD3和JZD3-C菌落邊緣可見孢梗束，而JZD3-M未見。多次點種JZD3，每平板都產生孢子型或菌絲型角變，或者兩類角變同時出現。

反復接種兩角變菌株，其菌落特征穩定，顯微鏡下觀察它們的產孢結構(圖1b)，由圖可知：JZD3、JZD3-C、JZD3-M產孢結構相似，都是典型的蟬擬青霉產孢結構；不同的是，JZD3和JZD3-C產生的孢子較多，菌絲較細；而JZD3-3孢子量少，瓶狀小梗尚可從基質菌絲上長出。

2．1．2 5種不同培養基上培養性狀觀察

3個菌株的菌落特征差異較大，JZD3和JZD3-C菌落平展，JZD3-M微隆起(圖2)。

在查氏培養基上JZD3、JZD3-C、JZD3-M生長速度相同(菌落直徑)，是生長最慢的培養基；3個菌株在查氏+0.1％蛋白胨培養基上達到最快的生長速度。在其余大多數培養基上的生長速度JZD3＞JZD3－C＞JZD3－M，對每個菌株而言情況也有差異。查氏培養基為基礎，隨著蛋白胨的增加，生長速度未必增加，達到某一濃度時，菌落直徑反而較小，有最適蛋白胨濃度。在試驗的蛋白胨濃度范圍內，JZD3－M沒有表現這樣的特征；JZD3和JZD3－C總體培養特征較相似：在沙氏培養基上，菌落平展，短絨毛狀，產生大量孢子，生長速度都不如JZD3－M。在其他培養基上，JZD3菌落濃密絨毛狀，JZD3－C菌落致密平展；JZD3－M在所有培養基上都是茸毛狀，菌絲濃密，白色。

JZD3在沙氏培養基上形成類似于JZD3－C和JZD3一M的兩種角變，而在其他培養基中未見產生，可見異核體分離出同核體受環境因素影響。JZD3菌株在沙氏培養基上較易分離，而查氏培養基有利于維持其穩定性。

2．1．3 5 種培養基上的產孢量

由圖3可知，在所有培養基上的產孢量都是JZD3＞JZD3-C＞JZD3-M；各菌株在不同的培養基中產孢量差異較大，查氏+0.01％蛋白胨培養基中，各菌株產孢量相對較高。沙氏培養基中JZD3達到最大產孢量，達到9.8×10⁸個/管，而JZD3-3的產孢量卻最少，只有0.12×10⁷個/管。查氏加蛋白胨的培養基中，并不是加入的蛋白胨越多，產孢量越大(這與菌落生長速度的結果相似)。

2．2 對蚜蟲的致病性

從致病性試驗可以看出，JZD3和JZD3-C(孢子型)對蚜蟲感染率相對較高，分別達到29.55％和8.39％，而JZD3-M(菌絲型)最低，只有8.93％。總體來講，JZD3和JZD3-C的菌落特征相似，對蚜蟲的致病性也比較接近。

2．3 生物活性物質的差異

測定結果表明(表2)，JZD3的胞外多糖含量達到249.77ug/mL，高于其他兩菌株；胞外多糖、SOD、POD三者的含量都是JZD3＞JZD3－C＞JZD3－M;JZD3-M蛋白質含量最高，達到413.70/zg/mL，遠遠高于其他兩菌株。

該試驗符合多糖含量與毒力成正相關的結論。SOD、POD都是功能食品和美容產品中的重要活性組分，同時它們也是抗逆酶，對真菌具有保護功能，試驗依據推斷這兩種酶有利于菌絲在蟲體生長，提高它們的殺蟲能力。

3 分析與討論

菌落出現扇形生長或其他性狀的生長部分的原因可能是突變，但較普遍的是異核作用。JZD3菌株在培養過程中出現兩種表型差異較大的扇形角變，多次接種該菌株出現相同的角變類型，而且分離培養發現兩角變都可以穩定遺傳。這基本上可以排除環境條件引起的暫時變異的可能性，初步推斷該菌株為異核體，而這種扇形角變是異核體發生分離所致，產生的兩角變分離株則是異核體分離出來的同核體菌株。另外，在昆蟲病原真菌中異核體往往具有比合成它的親本菌株更高的毒力水平，這也許是由于異核體具有比同核體更完整的基因，保存有更多的遺傳信息，體現雜種優勢的效果。殺蟲試驗也支持JZD3是異核體的結論。異核體的確證需要很嚴格的證明，單憑這些是不夠的，所以有待更進一步的研究。

分析3個菌株在不同培養基上的培養性狀，3個菌株對培養基成分的反應不一致，但體現出一定的規律性：JZD3和JZD3-C菌落特征比較接近(菌落平展，短絨毛狀，產生大量孢子)，在5種培養基上的生長變化情況也比較相似(有最適蛋白胨濃度)；在試驗范圍內，JZD3-M并未表現最適蛋白胨濃度，試驗數據至少可以得出這樣的結論，JZD3-M的最適蛋白胨濃度比其他2株高。另外，在沙氏培養基中，JZD3和JZD3-C都不如JZD3-M生長快。從這些形態方面的差異可以推測，3個菌株的營養要求不一致，反過來說明他們的生理狀況存在差異。生物活性物質結果也確實表明，JZD3和JZD3-C比較相似，胞外多糖、SOD、POD、蛋白酶含量都高于JZD3-M，而蛋白質含量則是JZD3-M最高。

蟬擬青霉是既古老又年輕的食藥用真菌，對害蟲也有較強的致病性。通過對ZD3菌株和兩角變分離株的培養特征、對蚜蟲的致病性以及多糖等活性物質含量方面的研究，表明蟬擬青霉同核體之間、同核體與異核體之間存在較大的形態和生理生化差異，一定程度上說明蟬擬青霉具有多樣性。進一步可以推測，異核體中各親本株所占比例的差異可以影響異核體的性質，實踐過程中，可以改變同核體比例，人工合成具有高藥理活性、對害蟲高致病性以及對環境的良好適應性等優良特性的異核體菌株，為蟬擬青霉的多功能開發提供一定的理論依據。從蟬擬青霉培養特征來看，菌落平展，短絨毛狀，產生大量孢子的菌株多糖含量、SOD、POD 3種活性物質的含量比較高，菌落特征也許可以作為菌株篩選的一個指標。倘若只考慮菌絲蛋白質含量，菌株篩選過程中，應該選擇菌落茸毛狀，菌絲濃密的菌株。