紅蓼拒食活性組分的分離及其對(duì)小菜蛾幼蟲消化酶活性的影響

摘要 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)紅蓼(Polyonum orientaleL.)的抗蟲性，采用液一液分配萃取和硅膠柱層析的方法，從紅蓼甲醇提取物中分離獲得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水的萃取物，測(cè)定了其對(duì)小菜蛾(Plutella xylostella)3齡幼蟲拒食活性。結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物比其他4種萃取物具有更高的拒食活性，在5.0mg/mL下，24 h和48h的拒食率分別為68.42％和62.55％。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析后，得到13個(gè)組分，比較13個(gè)組分的拒食活性發(fā)現(xiàn)，組分8的活性較高，在濃度為2.5 mg/mL時(shí)，24 h和48 h的拒食率分別為77.13％和68.53％。組分8對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)的蛋白酶、脂肪酶和a-淀粉酶的活性具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞 紅蓼；小菜蛾幼蟲；拒食活性成分

中圖分類號(hào)

紅蓼(Polygomum orientale L)屬于蓼科、蓼屬一年生草本植物，又稱東方蓼、狗尾花，為有毒植物。民間常用醫(yī)治清熱解毒、散結(jié)消腫、活血止痛等癥。本研究以小菜蛾(Plutella xylostella L)為試蟲，對(duì)紅蓼開展了拒食活性成分的分離，提純以及作用機(jī)理的初步研究，為尋找新的昆蟲拒食活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

紅蓼采自于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田。小菜蛾采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)附近甘藍(lán)菜田(未施任何化學(xué)藥劑)，在室溫為(25±1)℃，相對(duì)濕度(70±10)％，光周期L∥D＝14 h∥10 h條件下人工飼養(yǎng)。幼蟲飼喂白菜葉，成蟲飼喂10％蜜糖水，取同齡期的幼蟲供試。

1．2 拒食活性組分的提取、分離與活性測(cè)定

將采集的紅蓼洗凈，晾干或烘干(45℃)粉碎，過40目篩，采用冷浸提取法，得到甲醇提取物；采用液一液分配萃取，分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水層萃取物，測(cè)定各萃取物對(duì)試蟲的拒食活性方法如下：先用打孔器將新鮮的甘藍(lán)葉片打成直徑為1 cm的葉碟，再放入供試提取物樣品溶液中浸3 s即取出(對(duì)照組葉碟以丙酮溶劑作相同處理)。待葉碟晾干后，將其放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中(內(nèi)墊濾紙，加少量蒸餾水保濕)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入3片處理葉碟(對(duì)照為4片)，接入1頭饑餓6 h的3齡幼蟲。每處理重復(fù)10次，24、48 h用葉面積測(cè)量儀調(diào)查取食情況，并計(jì)算試蟲取食面積和拒食率。

拒食率＝對(duì)照組取食面積－處理組取食葉面積/對(duì)照組取食葉面積×100％。

采用硅膠吸附柱層析的方法，流動(dòng)相為石油醚丙酮溶劑，按不同的比例進(jìn)行洗脫，得到乙酸乙酯萃取物流分，經(jīng)硅膠板薄層層析，碘顯色，將顯色點(diǎn)相同的流分合并，得到13個(gè)組分并測(cè)定其拒食活性，以確定活性組分。

1．3 消化酶活性的測(cè)定

酶液制備：酶原的提取參照文獻(xiàn)[4]、[5]方法。將組分8用丙酮配制成所測(cè)濃度的藥液，將藥液均勻涂布在飼養(yǎng)小菜蛾的甘藍(lán)葉碟上，放人培養(yǎng)皿中，接入3齡小菜蛾幼蟲，每隔24 h更換濾紙，并用藥液重新處理新鮮葉碟，每處理10個(gè)重復(fù)。分別在12、24、36、48、60、72 h選取10頭試蟲，置于0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中，然后在冰浴條件下進(jìn)行勻漿。在4℃低溫下10 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。

1．3．1 蛋白酶活性的測(cè)定

蛋白酶的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]、[7]方法。

酶活力測(cè)定：取1 mL酶液，在37℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，加入預(yù)熱到37℃的1％酪蛋白溶液(pH＝7.0)，37℃保溫15 min，加入3 mL 10％三氯乙酸，混合均勻后4 000 r/min離心10 min。對(duì)照是將三氯乙酸和酪蛋白溶液的加入順序顛倒即可。離心結(jié)束后，取上清液2 mL，加入5 mL 0.5 mol/L的碳酸鈉，1 mL Follin-酚，37℃下顯色15 min，于752型紫外可見光光度計(jì)680 nm處比色。

在37℃下水解酪蛋白產(chǎn)生1 ug/min酪蛋白的酶量定義為一個(gè)活力單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出；與OD值相對(duì)應(yīng)的酪蛋白含量測(cè)定酶原蛋白含量，即可按下列公式計(jì)算出比活力。

酶的比活力(U)=酪氨酸含量(ug/mL)×酶稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時(shí)間(rain)×蛋白含量(mg/mL)。

1．3．2 脂肪酶抑制活性測(cè)定

甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照文獻(xiàn)[8]、[9]方法。

酶活力測(cè)定：取A、B兩支試管，各依次加入橄欖油乳劑2.5 mL，Tris-HCl緩沖液(pH=8.8)1.5 mL，酶液0.5 mL，立即蓋上帽子，顛倒5次。對(duì)A管立即在420 nm處測(cè)OD值；將B管在30℃水浴中溫育30 min后，在420 nm處測(cè)OD值，根據(jù)A、B管OD值之差，計(jì)算比活力(um01.mg^-1.min^-1)。

1．3．3 a-淀粉酶活性的測(cè)定

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和a-淀粉酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]、[11]、[12]方法。

酶活力測(cè)定：取A、B兩支試管，分別加入1 mL酶液和1 mL磷酸緩沖液(pH=8.0，0.02 mol/L)，在A管中加入2 mL 1％淀粉酶溶液，30℃水浴中溫育20 min，加入4 mL 0.4 tool/L NaOH；在B管中先加入4 mL 0.4 tool/L NaOH，搖勻后加入2 mL 1％淀粉液，在30℃水浴中溫育20 min。在A、B兩支試管中各取混合液1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定管，根據(jù)A、B管OD值之差，求比活力(mg.mg^-1.min^-1)。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS V8-1分析整理數(shù)據(jù)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan’s multiplerange test，DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同萃取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性

根據(jù)液－液分配法所得各萃取物配制成濃度為5 mg/mL，分別對(duì)小菜蛾3齡幼蟲進(jìn)行了拒食活性的測(cè)定(表1)。測(cè)定結(jié)果表明，與其他萃取物比較，乙酸乙酯對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性最高，24 h和48 h的拒食率分別為68.42％和62.55％。

2．2 不同組分對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性

將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，經(jīng)TLC檢測(cè)后，合并Rf值相同的流分，獲得13個(gè)組分，將所得各組分配制成濃度為2.5 mg/mL，對(duì)小菜蛾3齡幼蟲進(jìn)行了拒食活性作用的測(cè)定。其結(jié)果表明，在13個(gè)組分中，對(duì)小菜蛾幼蟲表現(xiàn)出不同程度的拒食活性，各處理組與對(duì)照組取食面積差異顯著。其中組分8的拒食活性最高，24 h和48 h的拒食率分別達(dá)到了77.13％和68.53％(表2)。

2．3 組分8對(duì)小菜蛾幼蟲消化酶活性的影響

2．3．1 組分8對(duì)小菜蛾幼蟲蛋白酶活性的影響

圖1是小菜蛾幼蟲在不同時(shí)間內(nèi)蛋白酶活性的變化。結(jié)果顯示，處理組試蟲體內(nèi)蛋白酶活性變化呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在處理后12 h，表現(xiàn)為處理組蟲體蛋白酶活性明顯高于對(duì)照組。由于組分8對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的影響和破壞，激活了昆蟲體內(nèi)蛋白酶的活性，表現(xiàn)出活性高于對(duì)照組。處理后24～72 h，處理組蟲體蛋白酶活性低于對(duì)照組，表現(xiàn)出明顯的抑制作用。處理組試蟲體內(nèi)的蛋白酶活性低于對(duì)照組，說明幼蟲接近老化，其體內(nèi)蛋白質(zhì)遭到一定程度破壞。

2．3．2 組分8對(duì)小菜蛾幼蟲脂肪酶活性的影響

圖2是小菜蛾幼蟲在不同時(shí)間內(nèi)脂肪酶活性的變化。從圖中可以看出，處理后12～48 h，處理組試蟲與對(duì)照組試蟲體內(nèi)脂肪酶活性變化呈上升趨勢(shì)，處理48 h后，兩者試蟲體內(nèi)脂肪酶活性都呈下降趨勢(shì)，處理組試蟲體內(nèi)的酶活性下降幅度明顯高于對(duì)照組，表現(xiàn)出明顯的抑制作用。說明組分8進(jìn)入小菜蛾幼蟲體內(nèi)抑制了脂肪酶的活力，可能是引起小菜蛾幼蟲死亡的一個(gè)重要原因。

2．3．3 組分8對(duì)小菜蛾幼蟲a一淀粉酶活性的影響

圖3是小菜蛾幼蟲在不同時(shí)間內(nèi)a-淀粉酶活性測(cè)定。結(jié)果顯示，處理組試蟲與對(duì)照組試蟲體內(nèi)。a-淀粉酶活性變化趨勢(shì)基本一致，所不同的是，60～72 h處理組試蟲體內(nèi)a-淀粉酶活性均有所下降，而對(duì)照組試蟲體內(nèi)a-淀粉酶活性呈水平直線趨勢(shì)。對(duì)照組高于處理組，有一定的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

植食性昆蟲對(duì)寄主植物的選擇是由于不同植物中含有不同的次生物質(zhì)所造成，這些物質(zhì)一般有防御昆蟲取食的作用，引起昆蟲離棄植物或拒絕取食。當(dāng)昆蟲對(duì)某些次生物質(zhì)不能適應(yīng)時(shí)，便不以含有這種成分的植物為食。從植物中分離出來的次生物質(zhì)多數(shù)對(duì)昆蟲會(huì)引起拒食作用。次生物質(zhì)對(duì)昆蟲作用性質(zhì)、方式和強(qiáng)度上的差異，是決定植物不同抗性水平的重要化學(xué)基礎(chǔ)，如對(duì)昆蟲有拒食作用的植物次生代謝物質(zhì)生物堿、酚類和萜類等化合物。本研究通過對(duì)紅蓼拒食活性物質(zhì)的分離，在5種溶劑萃取物中，乙酸乙酯萃取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性較高，24 h和48 h的拒食率分別為68.42％和62.55％。表明紅蓼拒食活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯溶劑中，將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，經(jīng)TLC檢測(cè)，對(duì)相同成分者合并后所得的13個(gè)組分并對(duì)其進(jìn)行拒食活性測(cè)試。結(jié)果表明小菜蛾幼蟲表現(xiàn)出不同程度的拒食活性，其中組分8的拒食活性較高，24 h和48 h的拒食率分別達(dá)到了77.13％和68.53％。由此可以看出，植物紅蓼中含有對(duì)小菜蛾3齡幼蟲拒食的活性物質(zhì)。對(duì)活性組分8，進(jìn)一步分離提純，得到3個(gè)化合物(另文發(fā)表)。

消化酶是由昆蟲中腸上皮細(xì)胞形成和分泌的，昆蟲對(duì)食物的消化主要依賴于分泌消化液中的消化酶。蛋白酶是昆蟲最主要的消化酶之一，其活性直接影響昆蟲對(duì)食物中蛋白質(zhì)的消化、吸收。不同的植物次生代謝物質(zhì)對(duì)昆蟲蛋白酶活性的影響往往各不相同。本試驗(yàn)小菜蛾幼蟲取食活性組分8處理的葉碟后，結(jié)果造成試蟲體內(nèi)蛋白酶活性降低，表明組分8具有拒食活性物質(zhì)，導(dǎo)致其取食不足甚至是完全拒食，使蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的原料缺乏。同時(shí)活性組分8對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)脂肪酶和a一淀粉酶活性有一定的抑制作用，筆者認(rèn)為作用于試蟲中腸細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，影響了中腸細(xì)胞合成消化酶的分泌減少，可導(dǎo)致消化酶活性的降低。而消化酶活性的顯著降低直接抑制了小菜蛾幼蟲對(duì)蛋白質(zhì)食物的消化、吸收，進(jìn)一步抑制了試蟲對(duì)食物的攝取、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收來維持生理功能和生長發(fā)育的需要，因而影響試蟲的正常生長發(fā)育(另文發(fā)表)。