遼細辛提取物對灰葡萄孢菌的抑制效果

摘要 采用生長速率法和孢子萌發法測定了遼細辛根的不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)粗提取物和精油對引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌菌絲生長和孢子萌發的作用。結果表明，細辛不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發均有一定的抑制作用，且對孢子萌發的抑制效果好于對其菌絲生長的抑制效果；石油醚提取物和精油的抑菌效果較好，對菌絲生長的EC₅₀分別為177.44 mg/L。和159.98 mg/L，對孢子萌發的EC₅₀分別為173.23 mg/L和125.29 mg/L；試驗還顯示細辛所含的主要抑菌活性成分易被極性小的有機溶劑所提取。

關鍵詞 細辛；灰葡萄孢菌；生長速率法；孢子萌發法；抑菌活性

中圖分類號 S482.292

1962年，美國作家R.Carson采用夸張的手法在《寂靜的春天》一書中將化學農藥使用所導致的副作用和存在的問題推向了輿論的前沿。農藥的使用所導致的社會和生態問題受到人們的日益關注，化學農藥的使用和作用遭到人們的普遍質疑。植物源農藥具有高效，低毒，無殘留，選擇性高，易與其他農藥相混配，與環境和諧，符合現代環保和人們健康的要求等特點而越來越引起世界各國的重視，近幾年掀起了一個研究開發植物源農藥的高潮。

遼細辛[Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]又名北細辛，為馬兜鈴科植物。細辛是重要的中藥，我國用藥歷史悠久，在2 000多年前就有用藥記載。細辛中揮發油成分(3％左右)是主要的抗菌物質，主要含有甲基丁香酚、香酯素、黃樟醚、細辛醚等。為進一步深入了解細辛提取物對植物致病菌的抑菌活性，評價細辛的藥物應用價值和作為植物源農藥的開發前景，本文以細辛精油及細辛不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)提取物為材料，初步研究其對黃瓜灰霉病病菌的菌絲生長和孢子萌發的抑制作用，為開發植物源殺菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 植物樣品及提取

以遼細辛根為材料進行試驗，樣品購自沈陽市中草藥市場，將其進一步陰干，粉碎，40目過篩。

為了有效地提取活性物質，選用極性不同的溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)組成一個溶劑系列，采用索氏提取器對樣品進行6～8 h提取(60℃)。采用2種不同方法提取細辛。溶劑系列的平行提取(分別提取)：即準確稱取樣品50 g，共4份，分別用300 mL石油醚、氯仿、乙酸乙酯和乙醇進行索氏提取。溶劑系列的分步提取(順序提取)：即準確稱取樣品120 g，用該系列溶劑對其依順序進行提取，先經石油醚提取，其渣繼以氯仿提取，以此類推。所得各提取液抽濾，旋轉蒸發儀濃縮，直到冷凝管中無溶劑滴下為止，回收溶劑，最后得到較濃油狀或漿狀的粗提取物，提取物稱重，計算提取率。密封，置4℃冰箱中保存備用。

細辛精油的提取：所用儀器為TC-SFE-42-5-120S超臨界萃取設備(沈陽天誠超臨界萃取有限公司制造)。稱取樣品1.85 kg，裝入5 L的萃取罐內，超臨界C02萃取：萃取壓力20 MPa，萃取溫度40℃，流量20 kg/h；解析釜I壓力6～7 MPa，溫度45℃；解析釜Ⅱ壓力5～6 MPa，溫度35℃，萃取時間為90min，每20 min收集1次提取物，稱量，密封，置4℃冰箱中保存備用。

1．2 供試菌株

供試菌種為引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)，由聊城大學農學院植物病理研究室提供。

1．3 藥液的配制

菌絲生長抑制試驗藥液的配制：先將細辛不同溶劑提取物和精油用少許無水乙醇(不超過總體積的2％)充分溶解，用無菌水配制成12 000 mg/L的母液，然后用無菌水稀釋成12 000、6 000、3 000、1 500、750 mg/L 5個濃度梯度，備用。

孢子萌發試驗藥液的配制：將細辛不同溶劑提取物和精油用二甲基亞砜配制成48 000、24 000、12 000、6 000、3 000 mg/L5個濃度梯度，備用。

1．4 生物測定方法

1．4．1 生長速率法

以生長速率法(瓊膠平板法)測定細辛不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用。所用培養基為PDA培養基，藥液終濃度分別為1 200、600、300、150、75 mg/L。菌餅直徑0.5 cm，每皿1塊，3次重復，(21±1)℃光照培養箱中培養。待對照菌落直徑在3 cm以上時，用十字交叉法測量菌落直徑。根據菌落直徑求抑制生長的百分率，公式如下：

菌落生長直徑＝兩次直徑平均值-0.5 cm；

菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100％。

1．4．2 孢子萌發法

以孢子萌發法(懸滴法)測定細辛不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制作用。以96孔微孔培養板代替凹槽載玻片。吸取孢子懸液78 uL與2 uL植物提取試驗藥液混合使之達到規定濃度(藥液終濃度分別為1 200、600、300、150、75 mg/L)，以二甲基亞砜(2 uL+78uL無菌水)為空白對照，3次重復，12 h觀察結果，根據下列公式計算抑制率：

萌發率=孢子萌發數/檢查孢子總數×100％；

孢子萌發抑制率=(對照萌發率－處理萌發率)/對照萌發率×100％。

1．5 毒力回歸線的建立

取細辛的不同溶劑提取物和精油各適當量，用水或二甲基亞砜等比稀釋成1 200、600、300、150、75 mg/L 5個系列濃度。試驗重復3次，建立毒力回歸方程。將抑菌的百分率轉換成幾率值，濃度轉換成對數，進行幾率值分析，求出細辛不同溶劑提取物和精油對病原菌的抑制中濃度(EC₅₀)。

1．6 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel軟件進行數據整理，經DPSv3.01統計軟件進行方差分析，線性回歸等由SPSS13完成。

2 結果與分析

2．1 供試植物樣品的提取率

遼細辛根采用超臨界CO₂法萃取精油和采用4種極性不同溶劑進行索氏提取，除去溶劑蒸干后，各樣品的提取率如表1所示。

提取率的高低反應了植物材料中溶于溶劑物質的多少。從表1可以看出，進行平行提取時，細辛根的不同溶劑提取物的提取率差異較小，石油醚的提取率較低，為4.08％；氯仿和乙醇的提取率較高，且很接近，在6.5％左右。進行分步提取時，細辛根的不同溶劑提取物的提取率差異較大，石油醚的提取率最高，為4.08％；其次為以乙醇作溶劑，提取率為2.44％；乙酸乙酯和氯仿的提取率較低，分別為1.65％和1.79％。遼細辛根的精油采用超臨界C02提取，1.85 kg的原料共萃取得到42 g精油，提取率為2.27％。

2．2 對菌絲生長的抑制作用

在供試條件下，以生長速率法測定了細辛精油及不同極性溶劑提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用，結果如表2所示。

由表2可以看出，細辛不同提取物對灰葡萄孢菌的抑菌效果均隨提取物濃度的增大而升高，在供試濃度下，表現出了較好的抑菌效果。

從平行提取結果看，當濃度＜300 mg/L，菌落直徑抑制率均低于50％；當濃度＞300 mg/L，菌落直徑抑制率均高于50％；濃度為300 mg/L，菌落直徑抑制率變化較大，石油醚提取物的抑菌效果最高，為60.58％，而乙醇提取物的抑菌效果只有31.37％；濃度為1 200 mg/L時，不同溶劑提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑菌效果均超過91％，處理間差異沒有達到極顯著；當濃度≤600 mg/L，各提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑菌效果表現出極顯著的差異。

從分步提取結果看，在同一提取濃度下，對菌絲生長的抑制率均隨提取步驟的增加而降低。如當濃度為1 200 mg/L時，石油醚提取物(第1步)的抑菌效果達到了100％，氯仿提取物(第2步)和乙酸乙酯提取物(第3步)的抑菌效果分別為50.26％和42.51％，而到第4步用乙醇提取時，其提取物的抑菌效果下降到27.01％。

比較細辛精油的抑菌效果可以看出，當濃度≥300 mg/L，菌落直徑抑制率均高于65％；濃度為1 200 mg/L時，抑菌效果達到了100％。總體看，細辛精油的抑菌效果與石油醚提取物的抑菌效果相接近。

根據細辛提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑菌效果，將抑菌的百分率轉換成幾率值，濃度轉換成對數，進行幾率值分析，求出了細辛提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制中濃度(EC₅₀)，結果如表3所示。

從表3可以看出，細辛精油的抑制效果最好，EC₅₀和EC₉₀。分別為159.98 mg/L和318.28 mg/L(轉換成樣品干重的質量濃度分別為7.05 mg/mL和14.02 mg/mL)；從平行提取結果看，4種極性不同溶劑提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑菌中濃度在170～350 mg/L之間，其中石油醚提取物的抑菌效果較好，EC₅₀為177.44 mg/L(轉換成樣品干重的質量濃度為4.35 mg/mL)，當比較EC₉₀時，4種不同溶劑提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制效果則表現出顯著差異：石油醚提取物的抑菌效果最好，EC₉₀為446.72 mg/L，其次為乙酸乙酯提取物，氯仿提取物和乙醇提取物的抑菌效果較差，EC₉₀均大于1 300 m4g/L；從分步提取結果看，隨著提取步驟的增加，提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制效果降低，石油醚提取物(第1步)的抑制效果最好，EC₅₀和EC9。分別為172.44 mg/L和347.06 mg/L(轉換成樣品干重的質量濃度分別為：4.23 mg/mL和8.51 mg/mL)；而乙醇提取物(第4步)的抑菌效果最差，EC₅₀和EC9。分別為2 904.2 mg/L和35 504 mg/mL(轉換成樣品干重的質量濃度分別為：119.02 mg/mL和1 455.08 mg/mL)。

2．3 對孢子萌發的抑制作用

以孢子萌發法測定了供試樣品對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制作用，試驗濃度下各處理的孢子萌發抑制率如表4所示。

由表4可知：細辛不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制作用也較好，變化趨勢與對菌絲生長抑制作用的趨勢相同。從平行提取結果看，當濃度為1 200 mg/L時，石油醚、氯仿和乙酸乙酯的提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑菌效果均超過95％，但乙醇提取物的抑菌效果卻只為83.27％。從分步提取結果看，在同一提取濃度下，對孢子萌發的抑制率也均隨提取物的進一步提取而降低。比較細辛精油的抑菌效果可以看出，在同一供試濃度下，其對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制率均高于其他溶劑提取物的抑制率。

根據細辛提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑菌效果，求出了細辛提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制中濃度(EC₅₀)，結果如表5所示。

從表5可以看出，細辛提取物對灰葡萄孢菌的孢子萌發具有較強的抑制作用。細辛精油的抑制效果最好，EC₅₀和EC9。分別為125.29 mg/L和252.90 mg/L(轉換成樣品干重的質量濃度分別為5.52 mg/mL和11.14 mg/mL)；從平行提取和分步提取的結果看，石油醚提取物對灰葡萄孢孢子萌發的抑菌效果均較好。

比較表3和表5，從EC9。結果可以看出：細辛不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制效果強于對菌絲生長的抑制作用。如在分步提取中，石油醚和乙醇提取物及精油對孢子萌發的EC₅₀分別為344.21 mg/L、2 266.70 mg/L和252.90 mg/L，而對菌絲生長的EC₅₀分別為347.06 mg/L、35 504 mg/L和318.28 mg/L。

3 結論與討論

從中藥植物中篩選植物源殺菌劑有廣闊的研究前景。本試驗采用平行提取法和分步提取法對遼細辛根的不同溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)粗提取物和精油對灰葡萄孢菌的生物活性進行了研究，采用生長速率法測定了供試樣品對菌絲生長的作用，采用孢子萌發法測定了供試樣品對孢子萌發的作用。結果表明，細辛根不同溶劑提取物和精油對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發均有一定的抑制作用，其中，精油和石油醚提取物對菌絲生長的抑菌效果較好，EC₅₀。分別為159.98 mg/L和177.44 mg/L，乙醇和氯仿提取物的抑菌效果較差，ECs。達341.49 mg/L和313.62 mg/L；精油對孢子萌發的抑制效果最好，ECs。僅為125.29 mg/L，其次為石油醚提取物，EC₅₀為173.23 mg/L，抑菌效果最差的為乙醇提取物，EC₅₀為390.35 mg/L。

對于同一種提取物來說，在供試條件下，細辛各提取物抑菌效果均隨濃度的加大而增高，且對其孢子萌發的抑制效果好于對其菌絲生長的抑制效果，如精油對灰葡萄孢菌孢子萌發的EC₉₀為252.9 mg/L；而對其菌絲生長的EC₉₀為318.28 mg/L。

對于同一種病原菌來說，在同一供試濃度下，細辛不同溶劑提取物的抑菌效果不同，總體來看，石油醚提取物的抑菌效果最好，而乙醇提取物的抑菌效果最差，說明細辛所含的主要抑菌活性成分易被極性小的有機溶劑所提取。精油的抑菌效果與石油醚提取物的抑菌效果相當，說明細辛精油中含有抑菌活性物質。

王樹桐等的研究結果表明：細辛的乙醇提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長，分生孢子萌發的抑制作用均與濃度呈正相關；細辛提取物稀釋100～600倍均對番茄灰霉病菌分生孢子的產生具有強烈的抑制作用。本試驗的研究結果與之相吻合。另外張國珍等的研究結果表明麻黃和細辛的揮發油對Alternaria panax等5種真菌的菌絲生長和孢子萌發均表現了一定的抑制作用，只是對于不同的真菌抑制生長的濃度有較大差別，而且2種揮發油還不同程度的表現出了一定的熏蒸作用，對Rhizoctoniasolani的IC₅₀分別為53.7 mg/L和87.8 mg/L，其熏蒸作用均隨培養時間的延長表現出不同程度的增強。李永剛等測試了30種中藥的抑菌活性，并認為10％的細辛水提取物對立枯絲核菌等有一定的抑菌效果。上述研究表明，細辛作為植物源殺菌劑，具有廣闊的開發利用價值。