紫油厚樸葉提取物對(duì)馬鈴薯青枯病菌的抑制作用及防病效果

摘要 采用快速萃取法提取了紫油厚樸葉中的有效成分，用其提取物對(duì)馬鈴薯青枯病菌進(jìn)行了抑菌作用及馬鈴薯青枯病的盆栽防治試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：紫油厚樸葉提取物在濃度為含厚樸總酚0.6、0.3、0.02、0.1 mg/mL時(shí)對(duì)馬鈴薯青枯病菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性厚樸葉提取物對(duì)受試的馬鈴薯青枯病菌的最低抑菌濃度(MIC)為厚樸總酚0.1mg/mL盆栽防治試驗(yàn)效果亦很好。

關(guān)鍵詞 厚樸葉提取物；馬鈴薯青枯病菌；抑菌作用；防治

中圖分類(lèi)號(hào) S482.292

農(nóng)藥是提高作物高產(chǎn)的重要生產(chǎn)資料，農(nóng)藥的有效使用可以大大地減輕病蟲(chóng)害危害導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。但農(nóng)藥在保護(hù)農(nóng)作物的同時(shí)也進(jìn)入了環(huán)境，是化學(xué)品中毒性較高、環(huán)境釋放率大和對(duì)生態(tài)影響大的物質(zhì)。生物農(nóng)藥具有簡(jiǎn)便、有效、對(duì)生態(tài)和環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，生物農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)一直是國(guó)際農(nóng)業(yè)高技術(shù)領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng)焦點(diǎn)之一。目前以Bt制劑、農(nóng)用抗生素和病毒殺蟲(chóng)劑為龍頭產(chǎn)品的生物農(nóng)藥已廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。 厚樸(Magnolia of ficinalis Rehd．et Wils．)屬木蘭科木蘭屬喬木，其樹(shù)皮、根皮以及枝皮為傳統(tǒng)的中藥材，具有極高的藥用價(jià)值。厚樸皮、葉和根中的生物活性物質(zhì)具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌作用，具有開(kāi)發(fā)成為生物殺菌劑的潛能。

恩施州具有豐富的厚樸資源，每年有大量的厚樸落葉沒(méi)有加以利用，如果能從厚樸落葉中提取得到一定的生物活性物質(zhì)并進(jìn)行進(jìn)一步的功能開(kāi)發(fā)，將可以變廢為寶，增加農(nóng)民收入，帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。本文快速萃取了紫油厚樸葉中的有效成分，用紫油厚樸葉提取物對(duì)馬鈴薯青枯病菌進(jìn)行了抑菌作用及馬鈴薯青枯病的盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1材料與試劑

厚樸葉取自湖北恩施市雙河鄉(xiāng)，為紫油厚樸的自然落葉。提取用無(wú)水乙醇、甲醇為分析純，HPLC甲醇為色譜純，厚樸酚、和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，馬鈴薯青枯病菌菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所馮潔研究員惠贈(zèng)，鄂馬鈴薯3號(hào)由湖北恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1．2 儀器

美國(guó)DIONEX公司ASE300型加速溶劑萃取機(jī)，66 mL萃取池；美國(guó)DIONEX公司P680LPG型高效液相色譜儀(P680四元梯度泵；TCC-100柱溫箱；紫外檢測(cè)器)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1．3 方法

1．3．1 厚樸葉中酚類(lèi)物質(zhì)的快速萃取

用ASE300型快速溶劑萃取機(jī)進(jìn)行，采用優(yōu)選的方法提取，取干燥的厚樸葉，粉碎，過(guò)60目篩，取適量，按4:1的比例加入硅藻土混勻后裝入萃取池，編程進(jìn)行萃取(萃取壓力為1 500 psi、無(wú)水乙醇提取3次、提取溫度91℃、提取時(shí)間為20 min/次)，萃取結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后定容備用，用甲醇稀釋后進(jìn)行HPLC測(cè)定含量。

1．3．2 酚類(lèi)物質(zhì)的含量測(cè)定

用RP-HPLC法分析。色譜柱：Diamonsil(TM)C18(250 mm×4.6 mm，5 gm)；流動(dòng)相：V(甲醇)：V(水)：V(冰醋酸)＝79:21:0.25；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；柱溫：23℃；進(jìn)樣量：20 uL。

1．3．3 菌懸液的制備

取馬鈴薯青枯病病菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平皿，34℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平皿中的單菌落接種于裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在34℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，振動(dòng)頻率250 r/min。用無(wú)菌水中制成10⁶～10⁷cfu/mL菌懸液。

1．3．4 提取物稀釋液的制備。

厚樸葉提取物用無(wú)菌水依次稀釋為含厚樸總酚0.6、0.3、0.2、0.1、0 mg/mL的不同梯度。

1．3．5 提取物抑菌作用測(cè)定

采用紙碟法測(cè)定其抑菌圈大小。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板表面接種50 uL菌懸液并涂布均勻，取已滅菌直徑6 mm并干燥的濾紙片，置于提取物稀釋液2 min，以溶劑作對(duì)照。50℃烘干后，用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片貼于平板表面，并輕輕按壓使充分接觸，每皿3片，34℃恒溫培養(yǎng)18～24 h；用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑(mm)。0.2 mg/mL的農(nóng)用鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照。

1．3．6 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用含毒介質(zhì)法，吸取1 mL提取物稀釋液溶解在9 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，混勻倒在平板上，以溶劑對(duì)照，冷凝；微量進(jìn)樣器取50 uL10⁶～10⁷ cfu/mL菌懸液于平板上并涂布均勻，34℃倒置培養(yǎng)18～24 h，菌落被完全抑制的最低稀釋度提取物濃度即為對(duì)受試菌的MIC。所有試驗(yàn)項(xiàng)目均重復(fù)3次。

1．3．7 盆栽防治試驗(yàn)

用20 cm×30 cm的花缽種植馬鈴薯(鄂馬鈴薯3號(hào))，精細(xì)管理，待馬鈴薯苗生長(zhǎng)至15 cm時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。設(shè)厚樸總酚含量分別為0.6、0.3、0.2、0.1 mg/mL 4個(gè)濃度，另設(shè)0.2mg/mL的農(nóng)用鏈霉素和空白對(duì)照，分別用2種施用方式。①用以上藥劑200 mL進(jìn)行灌根處理，48 h后接種50 mL的馬鈴薯青枯病菌菌懸液(10⁶～10⁷cfu/mL)。②先接種50 mL的馬鈴薯青枯病菌菌懸液(10⁶～10⁷ cfu/mL)，48 h后用以上藥劑200 mL進(jìn)行灌根處理。每個(gè)處理設(shè)9缽重復(fù)，記錄植株的生長(zhǎng)發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 紫油厚樸葉提取物對(duì)馬鈴薯青枯病菌的抑制作用

紫油厚樸葉提取物在濃度為含厚樸總酚0.6、0.3、0.2、0.1 mg/mL時(shí)對(duì)受試植物病原細(xì)菌馬鈴薯青枯病菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性(圖1)，抑菌圈直徑3次重復(fù)的平均值分別為22.5、21.7、16.3、13.1 mm，0.2 mg/mL的農(nóng)用鏈霉素抑菌圈直徑為20.7 mm，不同濃度提取物之間的抑菌活性有差異，有劑量依賴(lài)性。

2．2 紫油厚樸葉提取物對(duì)馬鈴薯青枯病菌的最小抑菌濃度

試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫油厚樸葉提取物對(duì)受試的馬鈴薯青枯病菌的最低抑菌濃度(MIC)為含厚樸總酚0.1 mg/mL就可以完全抑制其生長(zhǎng)。

2．3 盆栽防治試驗(yàn)

盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2，從表中可以看出，兩種處理的盆栽防治效果都在63％以上。處理1(先藥劑保護(hù)后接種細(xì)菌)的防治效果優(yōu)于處理2(先接種細(xì)菌后施藥劑保護(hù))。

3 討論

在抑菌試驗(yàn)中含厚樸總酚0.6 mg/mL和含厚樸總酚0.3 mg/mL的處理，沒(méi)有明顯的差異，可能是因?yàn)楹駱惴蛹昂秃駱惴釉诃傊桨迳蠑U(kuò)散能力有限，藥劑濃度加大到一定程度后有平臺(tái)效應(yīng)。在盆栽防治試驗(yàn)中，先藥劑保護(hù)后接種細(xì)菌的防治效果優(yōu)于先接種細(xì)菌后施藥劑保護(hù)，可能是因?yàn)橄仁┧巹┍Ｗo(hù)，待接種細(xì)菌時(shí)，藥劑對(duì)病菌有抑殺作用，病菌更難對(duì)植株形成有效的侵染。