高ＧＣ含量青枯菌ａａｃ基因ＰＣＲ擴增體系的建立與優化

摘要 通過添加增效劑、正交試驗設計優化PCR反應體系、聯合采用多種PCR程序等措施，建立并優化了PCR擴增體系，成功地從高GC青枯菌基因組中擴增出了長度為2434 bp且GC含量高達70.9％的aac基因。PCR反應體系為20uL包括5％DMSO、2.5 mmol/L MgCl₂、500 umol/L dNTP、10 pmol/L引物、1.25 U Taq酶、50 ng模板DNA。首先采用熱啟動PCR：95℃5 rain，保持80℃，加入Taq酶；然后采用二步PCR：5個循環包括變性95℃1 min，65℃1 min最后采用降落PCR：30個循環為95℃1 min，78℃1 min，每個循環降低0.5℃，72℃3 min補充10個循環為95℃1 min，63℃1 min，72℃3 min 72℃10 min。該試驗體系的建立與優化為研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。

關鍵詞 高GC；PCR；正交試驗

中圖分類號 432.42

植物細菌性青枯病是我國和世界范圍內廣泛分布和發生的一種重要細菌病害。病原為茄科青枯病菌(Ralstonia solanacearum nov．cornb E．F Smith，青枯菌)，侵染范圍廣，可達50多個科數百種植物，包括馬鈴薯、甘薯、番茄和煙草等，作為世界第四大作物馬鈴薯受青枯菌的侵染尤為嚴重。2002年法國科學家Salanoubat等在自然雜志上發表了青枯細菌GMI1000菌株的全基因組序列，青枯菌全基因序列的發表為今后克隆更多的致病相關基因，探究植物病原細菌的致病機理奠定了極其重要的基礎。但是，青枯菌全基因組具有較高的GC含量(平均為67％)，采用通常的PCR擴增是很困難的，特別是擴增高GC含量的大片段尤其困難。這是因為當DNA模板含有二級結構或其G+C含量較高時，PCR反應效率則會大為減弱，甚至無法擴增靶基因。本試驗通過添加增效劑、優化PCR反應體系和優化PCR反應條件3個方面的改進，成功地從青枯菌基因組中擴增出包含全2 434 bp，GC含量為70.9％的aac基因，建立了擴增高GC含量的長片段的方法。高GC aac基因PCR擴增條件優化試驗為研究像青枯菌這樣高GC生物的研究提供了重要參考。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株

青枯菌(Ralstonia solanacearum)GM11000由中國農業科學院蔬菜花卉研究所馮東昕老師提供。

1．1．2 試劑和儀器

Taq酶、dNTPs、DMSO等購自上海生工，500bp DNA ladder購自天根公司，引物由賽百盛公司合成。其他常規試劑均為進口或國產分析純。儀器有德國Eppendorf公司的Mastercycler gradient擴增儀和5415C型離心機，美國STRAGENE公司的Eagle Eye System凝膠成像系統，北京六一廠DYY-6B型穩壓穩流電泳儀。

1．2 方法

青枯菌GMI1000基因組DNA的提取參照顏子穎等的方法。根據GenBank上發表的植物青枯菌GMI1000的aac序列(NP 520668)用Primer Premier 5.0設計一對引物。上游引物從開放閱讀框的起始密碼子開始，下游引物為編碼區3’端外側序列。上下游引物：5，-CACCG-CATGACGCACGGATTC-3’、5，-CCGGT-TCAGGCAAACGCCCCG-3’，引物擴增片段大小為2 434 bp，包含完整的aac的閱讀框(ORF)。PCR條件在試驗中優化，擴增產物電泳后凝膠成像系統掃描保存。

2 結果

2．1 常規PCR擴增結果

反應體系為：總反應體系為20uL，模板DNA為50 ng，引物各為10 pmol/L，dNTP為300 umol/L，MgCl₂為2 mmol/L，TaqDNA聚合酶為1.25 U。反應條件為94℃預變性4 min；94 uC變性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30個循環；最后一步延伸10 min。采用常規的PCR擴增條件，無擴增條帶，圖1a所示。

2．2 使用增效劑和提高變性溫度的PCR擴增結果

反應體系為：總反應體系為20 uL，DMSO終濃度為5％，模板DNA為50 ng，引物各為10 pmol/L，dNTP為300 umol/L，MgCl₂為2 mmol/L，TaqDNA聚合酶為1.25U。反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性1 min，64～68℃(退火溫度的梯度為1℃)退火1 min、72℃延伸3 min，共30個循環；最后一步延伸10 min。通過加入增效劑和提高變性溫度至95℃，擴增出了微弱的目的條帶，圖1b所示。

2．3 正交試驗優化結果

正交試驗設計是根據統計學原理，研究各因素試驗的一種設計方法，它利用正交表來安排試驗。應用這個表安排的多因素試驗，通常是參與試驗的全部因素、水平的部分試驗，但由于正交法有正交性，所以用正交法安排的試驗就有均衡分散和整齊可比的特點，可以通過部分試驗，了解全面試驗的情況和因素之間的內在規律，較快的找到最優的水平組合。正交設計選用L₉(3⁴)正交表，設計包括各反應成分、循環條件的因素一水平表及試驗表，其中反應成分表如表1，2所示。由圖1c可知，只有9號PCR體系成功地擴增出了大小約為2.5 kb的aac基因。故9號試驗體系為最優體系，總反應體系為20uL，DMSO終濃度為5％，模板DNA為50 ng，引物各為10 pmol/L，dNTP為500umol/L，MgCl₂為2.5 mmol/L，Taq酶1.25 U。反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性1 min，64～68℃退火1 min、72℃延伸3 min，共30個循環；最后一步延伸10 min。但是9號體系仍然存在非特異性的擴增，下一步需要改進PCR程序以提高PCR擴增的特異性，減少非特異性條帶。

2．4 多種PCR聯合擴增結果

選用正交試驗的最優體系，聯合采用熱啟動PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特異性擴增，如下所述，首先采用熱啟動PCR：95℃5 min，保持80℃，加入Taq酶；然后采用二步PCR：5個循環包括變性95℃1 min，65℃ 1 min；最后采用降落PCR：30個循環為95℃1 min，78℃1 min，每個循環降低0.5℃，72℃3 min補充10個循環包括95℃1 min，63℃1 min，72℃3 min；72℃10 min。通過采用正交試驗的最優體系以及改進了的PCR程序避免了非特異性擴增，從而成功地擴增出了約為2.5 kb的單-PCR條帶即aac基因，如圖1d所示。本試驗成功地擴增出了大量特異性的PCR產物，為aac基因的克隆奠定了堅實的基礎。

3 討論

自從1985年Mullis等發明了聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR及其衍生物的分子生物學方法無論在人類基因組研究還是在疾病的病因、診斷及治療等方面的研究中均有舉足輕重的地位。然而PCR技術也不是沒有局限性的，如其忠實性就是棘手問題：它可能產生“假突變”或在引物并非完全匹配條件下產生“非特異”產物。其次PCR反應效率也是不容忽視的問題，當DNA模板含有二級結構或其G+C含量較高時，PCR反應效率則會大為減弱，甚至無法擴增靶基因。在本試驗中，采用常規的PCR條件無法擴增出任何條帶。這是因為aac基因GC含量達70.9％，容易形成二級結構。高GC含量PCR擴增的難點在于：(1)難變性，DNA模板在常規變性溫度(94℃)下，變性不完全。(2)難退火，由于DNA模板形成的二級結構，退火時引物不易與模板結合。(3)難延伸，由于DNA模板形成的二級結構，使PCR產物的延伸效率大幅下降。據報道，通過添加不同的增效劑如甜菜堿、二甲基亞砜、甘油、甲酰胺、吐溫-20等能夠使富含GC的DNA變性和減少DNA二級結構對PCR的影響。本試驗采用了不同濃度的甲酰胺，甘油，吐溫－20，二甲基亞砜，結果發現僅有5％的二甲基亞砜有效，但是擴增的目的片段微弱。這就說明有必要將PCR體系進行優化。筆者采用了正交法設計，充分考慮了PCR反應中每個因素同時變化對反應的影響，通過一次試驗就得到了較好的反應體系。這表明正交試驗是優化PCR反應體系的理想方法，但是仍然存在非特異性擴增。選用正交試驗的較優體系并同時聯合了熱啟動PCR、二步PCR、降落PCR以去除非特異性擴增。預變性采用95℃5 min，使具有復雜二級結構的模板DNA充分變性；二步PCR使得引物能夠與模板DNA充分結合；試驗中加入5％的DMSO減弱了模板DNA的二級結構的影響，便于Taq酶延伸；試驗也采用了熱啟動PCR和降落PCR以減少非特異性條帶，從而克服了高GC擴增3個難點。

總之，針對高GC基因難擴增的特點，首先，通過提高變性溫度和添加增效劑，消除復雜的二級結構的影響；其次，采用正交試驗設計，優化PCR反應體系；最后，通過改進PCR程序，以消除非特異性擴增，從而獲得了大量特異性的PCR產物。