手工挑取真菌單孢子顯微操作技巧

摘要 介紹了采用簡易挑孢針在普通顯微鏡下，手工直接挑取瓊脂培養(yǎng)基表面上的真菌孢子的操作技巧。雖然有一定的操作難度、技巧性強(qiáng)，但具有工具簡單、分離效率高以及可滿足特殊操作需要等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 真菌孢子；單孢分離；純化

中圖分類號 432.1

在植物病理學(xué)有關(guān)研究中，經(jīng)常要對病原真菌進(jìn)行單孢分離和純化，掌握一套高效的單孢分離技術(shù)，無疑對研究工作非常有益。已有許多方法可進(jìn)行單孢分離，比如稀釋分離法、瓊脂平板挖取法、玻璃毛細(xì)管分離法，固定昆蟲針挑取法，眉毛針挑取法，實(shí)體鏡下挑取法等。筆者在承擔(dān)《植病研究方法》本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，為了了解有關(guān)方法的特點(diǎn)，便于向?qū)W生介紹，及選擇一種恰當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?xùn)練學(xué)生的動手能力，對有關(guān)方法進(jìn)行了操作嘗試。實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)上介紹的方法各有特色，如用切取器在瓊脂平板上挖取分離法，容易被操作者掌握，但要求制備孢子分散度恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基平板，此程序操作繁瑣；實(shí)體鏡下挑取孢子法，操作方便，但高倍放大時，分辨率低，適用范圍受限。因此，實(shí)際工作中采用哪種方法，可隨工作條件、試驗(yàn)材料的不同及個人喜好而定。

在顯微鏡下用挑孢針手工直接挑取孢子的單孢分離方法，被認(rèn)為屬于大難度的技術(shù)，因而可能有許多人放棄采用該方法。其實(shí)，它并非想象的那樣困難。筆者在多年的工作中，一直在使用這套方法，通過對玉米、水稻、香蕉等多種作物上許多病原菌的分離，發(fā)現(xiàn)采用這套方法分離效率高，簡便實(shí)用，并具有一些獨(dú)特的長處。多年的操作實(shí)踐，使筆者積累了一些經(jīng)驗(yàn)，并摸索出一些操作技巧，現(xiàn)作簡要介紹。

1 儀器和工具

所用儀器是一臺狀態(tài)良好的普通生物顯微鏡。使用工具是一支自制簡易挑孢針，制作方法：用鑷子夾緊細(xì)小的普通縫衣鋼針，沿軸向?qū)撫樀拟g端插入普通鉛筆的橡皮頭中部，然后在酒精燈上燒紅針尖部，用鑷子將針尖彎曲2～3 mm，約成120°角，即成所需的挑孢針(圖1)。也可將常用的移植環(huán)的環(huán)頭去掉，換裝縫衣鋼針，并同樣彎曲針尖制成，只是這個挑孢針的針柄稍小，握針操作不如用鉛筆制作的穩(wěn)定。使用一段時間后，鋼針會逐步銹蝕，用刀片將針尖刮一遍后可繼續(xù)使用，當(dāng)顯微鏡下看到針尖明顯不平時，可換一根新的鋼針。也可用尖利的昆蟲針代替縫衣鋼針制作挑孢針。

2 操作環(huán)境

無需特別操作場地，可在干凈室內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)桌上進(jìn)行，有條件的在超凈工作臺上操作更好。

3 操作基本步驟和技巧

3．1 制備挑孢瓊脂塊

將普通瓊脂類培養(yǎng)基倒成薄平板，用刀片將平板切成2 cm×1 cm的瓊脂塊，挑一塊置于干凈的載玻片上即成。大量分離操作時，可預(yù)做專門的水瓊脂培養(yǎng)基，以稍硬一點(diǎn)的效果更好。

3．2 滅菌挑孢針的處理

使用前先將挑孢針柄(普通鉛筆)在酒精燈火焰上來回晃燒表面消毒(注意鉛筆易燃，勿燒過度)，并將針頭燒紅滅菌。

3．3 孢子取材

取出待分離的真菌材料，可以是病害病斑組織、大型真菌的菌褶，也可以是培養(yǎng)基上的菌落。用挑孢針頭的彎曲部在產(chǎn)生孢子的材料表面輕輕碰抹一下，粘附孢子，然后沿挑孢瓊脂塊的對角線輕輕劃一下，即可將孢子轉(zhuǎn)到挑孢瓊脂塊表面上。

3．4 顯微鏡下找到孢子

將載有孢子的瓊脂塊移到顯微鏡，在10×物鏡下觀察找到分散的孢子，并將單個孢子移至視野中間。

3．5 挑孢針的握拿和操作

右手以拿筆的方式握拿挑孢針，食指頭距針尖5～7 cm為佳，將燒過的針頭插入無菌水中蘸浸一下冷卻，移近顯微鏡，以無名指自然墊靠在顯微鏡載物臺上(手若懸空則很不穩(wěn)定)，將針頭移近物鏡，轉(zhuǎn)動針柄，使針頭的彎曲部分與瓊脂塊平面成銳角(約45°)，并輕輕靠在鏡頭下面。

3．6 碰取孢子

目鏡觀察，右手輕輕將針頭作前后或左右動作，至鏡下可見模糊的針尖端，然后使針尖慢慢往下移，鏡下可見針尖越來越清楚，當(dāng)針尖靠近瓊脂面時，可清楚看見粗大的針尖，將針尖輕輕向視野中間的單個孢子靠碰，有時一次靠碰孢子即可粘附到針尖上，更多的情形是要經(jīng)過多次靠碰，孢子才能粘附到針尖上，由于針尖粗大且不透明，粘到針尖上的孢子除非正處于尖頂部，否則一般是看不見的。當(dāng)視野中要碰取的單個孢子消失了，說明已粘到針尖上，此時輕輕抬起針頭，并移離顯微鏡。

這是關(guān)鍵步驟，難度大、技巧性強(qiáng)，原因是：①普通顯微鏡下針頭實(shí)際動作方向與視野顯示運(yùn)動方向是相反的；②手握挑孢針會有很輕微的抖動，放大視野下則是明顯的抖動；③針尖往往比一般的孢子大。但在熟練適應(yīng)后，并不會影響挑取孢子。

3．7 轉(zhuǎn)移孢子

左手取備好的試管斜面培養(yǎng)基，右手以普通移植操作方式將挑孢針移入試管，在培養(yǎng)基面上將針尖快速后退劃動1～4次，可將孢子釋放到培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)后長成單孢菌落。

3．8 重新操作

將針頭燒一下，重復(fù)3.5～3.7步操作就可挑取第2個孢子。當(dāng)遇到失誤動作，如針尖無意中碰及非無菌狀態(tài)的物品，或針尖碰到顯微鏡視野外的瓊脂表面，或針尖碰粘到2個以上的孢子，只需將針頭在火焰上燒一下，即可重復(fù)3.5～3.7步操作。注意燒紅的針頭馬上放入水中會崩裂，可在空氣中預(yù)冷幾秒鐘，再插入無菌水中冷卻。沒有無菌水時，將針頭插入空白的培養(yǎng)基也可達(dá)到冷卻效果。

4 分離操作技巧的拓展

4．1 將孢子分散

當(dāng)視野中孢子密布，找不到恰當(dāng)?shù)膯蝹€孢子下手時，可用針頭輕輕碰取幾個孢子(視野中有幾個孢子消失了)，輕抬針頭靠于物鏡下，左手轉(zhuǎn)動十字推進(jìn)器，轉(zhuǎn)到一個空白瓊脂視野，再輕輕將針頭往下移，靠碰到瓊脂面上，移開針頭，瓊脂視野上即見幾個孢子，此時再逐一碰挑這幾個孢子。可見，該技術(shù)對孢子在瓊脂面上分散與否沒有特別要求。

將孢子分散操作應(yīng)在目鏡觀察下進(jìn)行，如果眼睛離開目鏡，直接盯看針頭碰劃于瓊脂上，容易將瓊脂劃破，影響觀察；也可能會將孢子劃入瓊脂內(nèi)部；而且將眼睛移返目鏡后，不易找到這幾個孢子。

4．2 脫除孢子表面的細(xì)菌

一般對純培養(yǎng)菌落的孢子進(jìn)行分離，很少出現(xiàn)污染，但分離病斑組織上的孢子，尤其是經(jīng)過室內(nèi)保濕誘導(dǎo)產(chǎn)生的孢子如炭疽病菌分生孢子，容易污染細(xì)菌。脫除孢子表面細(xì)菌的具體操作是，將碰取的單孢轉(zhuǎn)移到無菌空白的瓊脂視野上釋放，燒過針頭，重新挑取這個孢子，重復(fù)對這個孢子釋放與挑取動作3～4次，再挑出轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)基，可明顯降低污染率。可能原因是孢子在水瓊脂面上翻滾，其表面的細(xì)菌已被粘附到瓊脂上。實(shí)際工作中偶爾會遇到一些難得的、量少且發(fā)病已久的病害標(biāo)本，使用該操作技術(shù)對保證分離成功很有利。

4．3 分離子囊孢子

取2塊已滅菌的載玻片，在一塊的一端加入1/3滴無菌水，挑取一顆成熟的子囊殼或切取有性子實(shí)體的一小塊置于水滴中，用另一塊載玻片的一端研壓子囊殼，將壓碎物輕輕抹在挑孢用的瓊脂塊面上，鏡下可見大量的子囊孢子，可對這些子囊孢子實(shí)施單孢分離。筆者可方便地分離稻曲病菌的子囊孢子。這種玻片壓碎法操作也適用于分離分生孢子器內(nèi)的孢子。

在真菌遺傳學(xué)研究中，有時需要分離單個有性子囊內(nèi)的8個子囊孢子，如果沒有專門的分離設(shè)備，此項(xiàng)工作的確有挑戰(zhàn)性。本文的技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單個子囊內(nèi)的8個子囊孢子的分離。方法是，在用玻片壓碎子囊殼時控制下壓力度，可獲得一些未壓破的完整子囊，用挑孢針在鏡下將完整的單個子囊轉(zhuǎn)移到一空白的挑孢瓊脂塊上，用挑孢針尖不斷碰刮子囊，使子囊壁破開，露出內(nèi)部的子囊孢子，再將這些孢子逐一分離出來。筆者曾成功分離玉米小斑病菌單個子囊內(nèi)的8個子囊孢子。

4．4 分離微小孢子

一般大于5um的孢子在10×物鏡下清楚可見，可以較方便的實(shí)施單孢分離。當(dāng)研究材料的孢子微小且顏色較淺時，一般需要40×物鏡才能清楚檢視，但40×物鏡鏡頭與瓊脂面的間距太小，無法實(shí)施挑孢動作。遇到這種情況可將這些微小的孢子分散在瓊脂培養(yǎng)基面上，適溫下培養(yǎng)萌發(fā)，當(dāng)長出一小段芽管后，一般在10×物鏡下就能清晰可視，此時再實(shí)施單孢分離。如稻曲病菌薄壁分生孢子無色細(xì)小(3～5um)，10×物鏡下，有時與培養(yǎng)基中的一些雜質(zhì)不易區(qū)別，當(dāng)將這些孢子在27℃培養(yǎng)10～15 h，孢子萌發(fā)出芽管時，就很易于辨認(rèn)和實(shí)施單孢分離。

4．5 挑取單菌絲片段

對于不產(chǎn)孢的菌株，可用挑孢針在菌落表面反復(fù)刮擦，并粘取少許轉(zhuǎn)移到挑孢瓊脂塊上，按分離孢子的步驟和技巧，挑取單根菌絲段。

5 結(jié)語

用挑孢針手工顯微挑取孢子法有如下優(yōu)點(diǎn)，①單孢子可靠；②單孢分離效率高，10 min可分離5～7個孢子；③適用性好，可分離各種基質(zhì)上的孢子，也可分離不同種類和大小的孢子；④可進(jìn)行特殊需要的操作，比如分離單個子囊內(nèi)的孢子，脫除孢子表面的細(xì)菌等；⑤工具簡單，主要由一根普通縫衣鋼針制成，可隨時購買制成工具；⑥簡便實(shí)用，可在一般的場地，作簡單的準(zhǔn)備，用少量的材料即可實(shí)施單孢分離。這種分離技術(shù)雖然操作難度大、技巧性強(qiáng)，但也能很快學(xué)會和熟練。筆者曾指導(dǎo)本科生的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，他們開始時均覺得有操作難度，但經(jīng)過1個上午的練習(xí)，就能掌握基本要領(lǐng)，再經(jīng)1天的訓(xùn)練就可以基本熟練操作，因此，這種看起來似乎困難的單孢分離技術(shù)還是容易掌握的。