乙肝血清標志物ＥＬＩＳＡ檢測過程中的質量控制

摘 要：乙肝血清標志物是臨床常用的檢測項目，常用的檢測方法為酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。在日常工作中，影響其檢測的因素較多，常出現一些臨床和實驗室解釋困難的結果或者在不同的醫院甚至同一醫院內結果不具有可比性，因此保證ELISA檢測結果的可靠性顯得尤為重要。本文現就其ELISA法檢測乙肝血清標志物在實際操作中易出現的問題和質量控制措施加以分析。

關鍵詞：乙肝血清標志物；酶聯免疫吸附試驗；質量控制

中圖分類號：R512.6+2 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)05-084-02

乙肝感染呈全球性分布，可能半數以上世界人口曾受感染，每年發生5000萬例新感染，每年100萬人死亡。由此可見，我國乙肝流行狀況十分嚴峻。但是在檢測乙肝病毒標志物時要注意假陽性和假陰性結果的出現，不能因假陽性引起患者的心理壓力和精神痛苦，造成不必要的糾紛。也不能出現假陰性結果，以利于患者的早發現、早診斷、早治療。乙型肝炎病毒血清學標志物(HBVM)是目前臨床分析和判斷乙型肝炎病毒感染病程及其傳染性的重要依據，常用方法是ELISA法，其商品試劑盒和自動或半自動酶標檢測儀現已經在各級醫院臨床檢驗中普及應用。現階段，由于我國ELISA法檢測乙肝血清學標志物多采取手工方式操作，影響因素較多，為保證測定結果的準確性和可靠性，實驗室必須重視質量管理，下面就我們在實際工作中的體會匯報如下。

1 乙肝標志物ELISA檢測過程中的影響因素分析

首先是，試劑盒的質量和試劑的運輸與貯存。試劑盒質量是關系到ELISA檢測結果準確度的核心問題，目前我國生產ELISA試劑盒的廠家眾多，產品質量也參差不齊。資料顯示，不同廠家試劑的敏感性為89.4%~99.3%，存在較大差異。同時ELISA試劑盒熱穩定性差，遇熱后靈敏度、特異性都將降低。而ELISA試劑盒的貨架壽命只有6個月，這樣就要求試劑盒在4~10℃下運輸貯存，各實驗室在貯存環節上都能達到要求。但目前在炎熱的夏季無法保證試劑盒的冷鏈運輸。試劑盒經過幾天的長途高溫運輸，其貨架壽命將消耗殆盡，如各實驗室還按說明書的有效期使用至6個月，檢測結果的準確性將無法保證。其次是檢測過程中的操作失誤，如加樣標本離心去血清或血漿時分離不好，有紅細胞、標本溶血或相鄰標本加樣時污染。孵育時未封閉，造成標本或稀釋液蒸發，吸附于孔壁難以洗清。孵育時間人為延長，造成非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以洗清。手工洗板時，孔與孔之問相互污染。洗板不完全，未洗凈，反應板過多造成洗板等待時間延長。顯色顯色劑放置時間過長、使用過期顯色劑或加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。

影響ELISA法檢測乙肝標志物的因素很多，除上述因素外還與內源、外源物質的干擾有關，檢測室的環境與質控體系及使用者素質等都影響到檢測質量。

2 加強乙肝標志物ELISA檢測質量控制的措施

2.1 建立質量控制標準

首先是檢測人員要參加質控學習班和學術交流，積極參加關于質量控制的學習交流，統一認識，了解質量控制方面的動態和進展，分析失控的原因，找出差距，制定整改措施，實施于實際工作中。其次要注重臨界值血清的使用。所謂臨界值就是陰性和陽性的臨界值，當達到這一水平時，必須采取某些醫療措施。工作中應把臨界值血清做成陽性結果，以此來保證實驗的可靠性，臨界值血清具有以下優點：其含量低，是界于陰性的弱陽性血清，為低值陽性標本的檢出提供參照。該血清顯示結果時顏色較淺，但肉眼可以分辨出與陰性對照不同，這就增加了一個判斷何時終止酶促反應的標準。該血清有利于提高不同實驗室結果的可比性。所以，臨界值血清的使用，可以避免低值陽性標本，建立統一的標準，提高不同實驗室結果的可比性。

2.2 注重測量前的質量控制

首先要保證ELISA實驗儀器的準備妥當，包括加樣器和酶標儀的校準和洗板機的工作狀態完好。由于多采用商品化試劑盒，不同廠家的產品質量參差不齊，所以必須選擇中華醫學會檢驗學會推薦的產品，具有國家衛生部正式批準號，其靈敏度、特異性、精密性、穩定性都滿意的試劑盒。在選定試劑后，還必須注意在試劑的有效期內使用，不同廠家產品不能混用，對每批試劑必須抽樣進行評價。另外根據我們的經驗，最好長期使用一家中華醫學會推薦公司的產品，這樣不僅便于保證結果具有一定的穩定性還便于發現試劑的質量問題，以便及時更換和取得公司的技術支持。同時必須遵守實驗室內質控原則，經過嚴格選擇的試劑進入實驗室后，由于免疫試劑由生物活性物質制備而成，任何因素的變化均影響其質量和穩定性，如保存時間、運輸條件等，因此，仍需實驗室對其質量進行室內質控，最好使用兩種不同濃度的質控血清，這樣才能保證檢測質量。制定“三查七對把七關、全部機洗+質控”的檢測質量控制等杜絕差錯的具體措施。同時操作人員必須有一定的專業知識和實踐經驗，能認真貫徹質量控制的措施，有良好的職業道德和責任心。

2.3 嚴格操作

我們要按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用試劑。蒸餾水要新鮮，從冰箱取出試劑應待溫度與室溫平衡后再使用，試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。加樣器在使用前必需經過校對方可使用，加樣時力度要求一致所加樣品應加在板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可淺出，不可產生氣泡。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染。一切加量均須準確，微量加液器長期使用后彈簧硬度和密封性變差，影響吸取標本的準確性，須定期校正加液器，尤其是加顯色劑和中止劑的量不準確時，將帶入較大的誤差，建議使用電子加樣器。嚴格按操作規程控制溫度及反應時間，因為溫度高則破壞了酶的活性，溫度過低則反應不完全，反應時間過短會直接影響酶的吸附作用。洗滌在ELISA法試驗過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA法就是靠洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中，非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。因而洗滌時，洗液要新鮮，注滿各孔又不使洗液流出，靜置1~2min，扣干水分，再進行下一次。洗滌完畢將板在吸水紙上扣干再顯色。顯色是ELISA法的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨著時間的延長而呈色加強，一些弱陽性的標本可顯示強陽性。另外滴加顯色劑時，瓶子要垂直，A液B液的量要相等，以免影響測出的值。在比色時，選好所需的波長，擦干板上的水份。

2.4 測量后的質量管理

嚴格按照說明書判定結果。必須通過酶標儀讀取吸光度值，計算出S/CO，按照說明書所標示的公式判定陰、陽性結果，肉眼觀察結果容易引起誤判。質控血清檢測的結果繪制Levey-Jennings質控圖，限度應在1-2SD內，如一次超過±3SD或連續兩次超過±2SD為失控。當出現乙型肝炎病毒血清學標志物罕見的模式時，應首先排除“HOOK”效應以及高濃度類風濕因子、補體及嗜異性抗體等內源性因素的干擾所導致的誤差，通過對血清標本的處理如血清標本加入IgM抗體來中和類風濕因子，或者用2-巰基乙醇加入標本稀釋液中使類風濕因子降解；另外用EDTA稀釋標本或者用53℃、10分鐘加熱血清能在一定程度上消除干擾。如果是操作因素的原因如血液凝固不全，血清中還含有纖維蛋白導致的假陽性，可將標本重新離心后取血清進行復查的方式得到解決，同時檢測報告發出前必須認真審核，杜絕差錯。

總之，影響ELISA檢測的因素眾多，檢驗人員一定要有高度的責任心，要注意假陰性、假陽性結果的出現，對可疑標本一定要進行復檢，以有利于患者的早發現、早診斷、早治療，采取必要的防護措施，為臨床提供正確可靠的檢測結果。

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(責任編輯：萬賢賢)