３，６－二羥黃酮對ＨＬ－６０細胞生長增殖的影響

【摘要】 目的 觀察3，6-二羥黃酮對HL-60細胞的影響。方法 分別用臺盼藍拒染觀察藥物對細胞的毒性作用，流式細胞術、Hoechst 33258/PI熒光雙染和瓊脂糖凝膠電泳觀察藥物對細胞周期的影響以及凋亡情況。結果 3，6-二羥黃酮對HL-60細胞具有明顯地細胞毒作用，呈一定的時效性；流式細胞術、熒光雙染和瓊脂糖凝膠電泳實驗，發現了典型的凋亡細胞，且隨藥物濃度的增加，凋亡細胞數明顯增加；然而統計學分析發現3，6-二羥黃酮并沒有引起HL-60細胞周期的變化。結論 3，6-二羥黃酮能明顯地抑制HL-60細胞的增殖，并能引起細胞的凋亡。

【關鍵詞】 3，6-二羥黃酮；HL-60細胞株；凋亡

文章編號：1003-1383(2008)02-0119-04 中圖分類號： Q 555.7; Q 784;Q 814.1；R 963 文獻標識碼：A

Effect of 3，6-Dihydroxyflavone on proliferation ofHL-60 cell lines[HJ1*2]

LI Chunmei1， LIU Xinguang2，LIANG Nianci2

(1.Department of Biochemistry Molecular Biology，Guangdong Pharmaceutical College， Guangzhou 510006;2. Institute of Biochemistry Molecular Biology，

Guangdong Medical College， Zhanjiang 524023)

【Abstract】 Objective To observe effect of 3，6-dihydroxyflavone on the proliferation of HL-60 cell lines.

Methods The effect of 3，6-dihydroxyflavone on the proliferation of HL-60 cell lines was detected by Trypan blue dye exclusion assay， the changes of the cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM)， the apoptosis was analyzed by FCM， Hoechst 33258/PI fluorescence staining and DNA agarose gel electroporesis.Results 3，6-dihydroxyflavone had strong cytotoxicity to HL-60 cell lines with dependence of time， While abnormality of cell cycles could not be induced. After treated with 3，6-dihydroxyflavone for 36h， HL-60 cell line could be induced apoptosis， which was confirmed by FCM，fluorescence staining and DNA agrose gel electroporesis.Conclusion Conclusion 3，6-dihydroxyflavone could strong inhibit the proliferation of HL-60 cell lines and could induce apoptosis.

【Key words】 3，6-dihydroxyflavone;HL-60 cell lines;apoptosis

白血病是一種血液惡性腫瘤，白血病細胞喪失分化、成熟的能力以及異常增殖，致使惡性細胞在體內積累。白血病對人體有極大的危害，發病率較高，為2.76/10萬，白血病的治療在當今世界上仍是一大難題。

有關3，6-二羥黃酮（化學結構見圖1）與腫瘤細胞關系的報道很少，僅有學者研究了它對幾種不同的細胞周期的影響［1］，發現30 μmol/L 的3，6-二羥黃酮能升高SF295、SKOV3、HCT15、HCT15/CL02等多種癌細胞株S期細胞數。

本實驗首次在體外觀察3，6-二羥黃酮對人早幼粒白血病細胞株HL-60生長增殖的影響，并探討其抗腫瘤作用與細胞凋亡的關系。

材料與方法

1.材料 3，6-二羥黃酮購于美國Aldich公司；人早幼粒白血病細胞株HL-60為廣東醫學院生化所保存；RPMI-1640購于美國Gibco公司；新生小牛血清購于杭州西季青生物公司；PI、EB、RNase A、Hoechst 33258均購于美國 Sigma公司；其余為國產分析純產品。

2.細胞培養 人早幼粒白血病細胞株HL-60培養于含有10%滅活的小牛血清、100U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉

※基金項目：國家自然科學基金（No.30672205）；廣東省自然科學基金項目（No.011766， 05011579）；廣東省科技計劃項目（No.2002C30109）；廣東藥學院學院課題資助項目。作者簡介：李春梅（1977-），女，山東省濰坊市人，生物化學講師，碩士學位。通訊作者：劉新光（1964-），男，江西省九江市人，生物化學教授，博士學位，博士生導師。

素的RPMI-1640完全培養基中，37℃、5%CO₂飽和濕度孵箱孵育，取對數生長期細胞實驗。

3.藥物的配制 用DMSO配成原液，分裝凍存，臨用前用DMSO稀釋成所需濃度。藥物作用于細胞時，DMSO的終濃度等于0.1%（v/v），實驗表明該濃度對細胞生長增殖無影響。

4.臺盼藍拒染法檢測3，6-二羥黃酮對HL-60細胞生長增殖的影響 參考文獻［2］收集對數生長期的細胞，PBS洗3次，調整細胞濃度0.5×105~1.0×105/ml，分裝于24孔板，每孔1 ml，加入1 μl不同濃度藥物，每組設4個平行孔，并設空白對照孔。細胞加藥后置于37℃、5%CO₂飽和濕度孵箱培養，加入臺盼藍染色，用臺盼藍拒染法在鏡下計活細胞數，按下式計算不同濃度的藥物對細胞的生長、增殖抑制率（IR）。抑制率（Inhibitory rate，IR）=（1用藥組活細胞數/空白組活細胞數）×100%；按改良Karber公式計算IC50：

【其中I=log(最大劑量/相鄰劑量)；Xm=log最大劑量；P=陽性反應率之和；Pm=最大陽性反應率；Pn=最小陽性反應率】

5.流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡細胞 參照文獻［3］，略有改動。分別收集不同濃度藥物處理的細胞1.0×10⁶，PBS洗3次，用70%（v/v）的冷乙醇4℃固定過夜。上機前收集細胞，用PBS洗滌細胞除去乙醇，用碘化丙啶（PI）染液（含20 μg/ml PI，0.25 μg/ml RNase A），室溫染色30 min。過濾，流式細胞儀（FCM）檢測，資料經LysisⅡ收集、貯存、分析。

6.熒光染色 參照文獻［4］，略有改動。收集對數生長期的細胞，PBS洗3次，調整細胞濃度2.0~3.0×105/ml，加入6孔板中，加入不同濃度的藥物，并設空白對照組，處理一定時間后，收集細胞，加入熒光染料Hoechst 33258和PI，至其終濃度分別為10 μg/ml和20 μg/ml，37℃避光染色30 min，紫外光激發，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態及顏色改變以區分出正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并拍照。

7.瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段化 參照文獻［5］，略有改動。收集107細胞，PBS洗滌離心沉淀細胞，用50μl裂解液（1%NP-40、20 mmol/L EDTA、50 mmol/L TrisHClpH=7.5）處理細胞10 s，1 500 g離心5 min，收集上清液，再用50 μl裂解液重復處理1次，合并上清液，加10%SDS，2 μl 10 mg/ml RNase A，混勻，37℃水浴2 h，加入4 μl 20 mg/ml 蛋白酶 K于56℃處理2 h，加入70 μl 10 mmol/L NH4Ac，600 μl無水乙醇沉淀DNA， 4℃，15 000 g，離心15 min，真空干燥，TE Buffer溶解DNA，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（恒壓），觀察并拍照。

8.統計學處理 計量資料以-±s表示，采用SPSS 11.0進行單因素方差分析，P＜0.05為有統計學差異。

結果

1.臺盼藍拒染法檢測藥物的細胞毒性作用 不同濃度的3，6-二羥黃酮分別作用于人早幼粒白血病細胞株HL-60不同時間，用臺盼藍拒染法觀察它的增殖抑制效果。結果表明（見表1）：當時間不變時，隨著3，6-二羥黃酮劑量的增大，對HL-60細胞株抑制作用增強，且呈劑量依賴性；在同一藥物濃度情況下，隨著藥物作用時間的延長，藥物對細胞株增殖的抑制作用也有所增強，呈時間依賴性。當0~160 μmol/L的3，6-二羥黃酮分別處理細胞12 h、24 h和36 h，計算其半抑制濃度IC50值分別為166.79 μmol/L、59.01 μmol/L、22.94 μmol/L。選擇36 h作為后續研究的作用時間。

2.流式細胞儀檢測結果 當細胞發生凋亡時，內源性核酸內切酶激活使DNA廣泛降解、斷裂，DNA結構發生劇變，細胞內總DNA量降低。流式細胞儀（FCM）可以檢測凋亡時DNA的這種結構及量的變化，于正常G0/G1細胞期前出現一DNA低染細胞群，稱“A0細胞群”即凋亡細胞群。當藥物濃度在0～160 μmol/L范圍內，3，6-二羥黃酮作用HL-60細胞36h，對細胞周期無明顯影響（P均＞0.05），卻能導致HL-60細胞的明顯凋亡，當藥物濃度為40 μmol/L時，開始出現凋亡峰，凋亡率為2.5%，當藥物濃度達160 μmol/L時，凋亡率達38.5%（見圖2及表2）。

3.熒光染色結果 凋亡細胞細胞膜通透性有所增加，因此，藥物處理后的細胞經Hoechst 33258/PI雙重染色后，外形不規則被染成紅色熒光的細胞為壞死細胞；細胞體積縮小而完整，被染成亮藍色的是凋亡細胞；而正常活細胞對染料有拒染性，細胞核成均勻彌散淺藍色熒光。熒光雙染結果（見圖3）顯示，3，6-二羥黃酮處理過的HL-60細胞，可以見到典型的凋亡細胞，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞數目明顯增加。

4.DNA斷裂的凝膠電泳圖譜分析 凋亡的主要生化標志是內源性鈣鎂離子依賴性核酸內切酶被激活，導致細胞DNA廣泛斷裂，形成大小不一的DNA片段，從而在瓊脂糖電泳上呈現規則的、間隔180～200堿基對的“DNA梯”。圖4顯示不同濃度的3，6-二羥黃酮作用HL-60的DNA斷裂的凝膠電泳圖譜，當藥物濃度較低時，未出現“梯”，且在同一分子量位置出現了分子量較大的一條帶，表明未發生凋亡，也可能是由于發生凋亡的細胞數未達到出現“DNA梯”的細胞數；隨藥物濃度的增加，“梯”現象更加明顯。

討論

腫瘤的形成是基因調控的細胞增殖失控、分化異常和（或）細胞凋亡過程受到抑制兩方面共同作用所致。因此，誘導腫瘤細胞凋亡對腫瘤的發生發展機制的研究及其治療，都具有十分重要的意義。由于抑制細胞增殖的可能機制主要有三種：一是引起細胞的死亡（包括凋亡）；二是引起細胞周期各時相的等比例延長；三是細胞被阻滯在周期中的某一個時相。

為探討3，6-二羥黃酮對HL-60細胞的影響情況，本實驗采用了臺盼藍拒染法和流式細胞術等方法。結果發現：3，6-二羥黃酮對HL-60細胞有明顯的細胞毒作用，呈一定的時效性；流式細胞術和Hoechst33258/PI熒光雙染實驗，均發現典型的細胞凋亡現象，且隨藥物濃度的增加，凋亡細胞數明顯增加；然而統計學分析顯示3，6-二羥黃酮并沒有引起HL-60細胞周期的變化。提示3，6-二羥黃酮對HL-60細胞的細胞毒作用，可能主要是通過誘導細胞凋亡而發揮作用的。此外，3，6-二羥黃酮能提高細胞核酸內切酶的活性，從而使其DNA電泳圖譜上觀察到明顯的ladder出現。

凋亡是細胞受到某些因素刺激后一種主動的由凋亡相關基因調控的“自殺”過程，亦稱細胞程序性死亡，是細胞在其分裂、增殖、分化和衰老死亡中具有十分重要作用的生物學現象。它在維持細胞內環境穩定，維持機體的正常發育和組織狀態有重要意義。生理性細胞凋亡機制紊亂將導致發育異常和加速腫瘤發生和惡化。故有人提出腫瘤生長的主要原因不是腫瘤細胞受刺激大量增殖的結果，而是細胞凋亡抑制劑和腫瘤促進劑等延長了已轉化的細胞生存期限的結果。促進和誘導細胞凋亡是治療腫瘤和逆轉腫瘤細胞耐藥的一種新思路，也是當今抗腫瘤研究的熱點之一。

本文從DNA片段化分析，細胞形態學分析證明3，6-二羥黃酮具有誘導HL-60細胞凋亡的作用，但有關其誘導凋亡的具體機制未清。然而，本課題組實驗證明3，6-二羥黃酮在胞外能顯著抑制重組人蛋白激酶CK2的活性［6］，但是卻對細胞內CK2活性沒有明顯的影響（數據未列出），因此其誘導HL-60細胞凋亡的機制可能與胞內CK2的活性無關，懷疑可能與CK2在細胞內的核定位有關。有些研究表明［7］：CK2的亞細胞定位是高度動態的。Guo等［8］提出，一些化學誘導的凋亡可能引起細胞核基質內CK2活性的升高，這可能是因為CK2從胞質中被轉運到核間隔中，CK2穿梭到核基質可能是對化學誘導的凋亡的一種保護性行為。轉染了CK2α基因的細胞能明顯抑制化學誘導的凋亡，而相應的核基質內的CK2有所升高，因而他們提出CK2在抑制細胞凋亡方面發揮了作用。2001年1月在智利召開的第三屆蛋白激酶CK2國際會議上，更是進一步提出CK2有抑制細胞凋亡的功能。接著，Pinna實驗室［9］又證實了目前最特異的CK2抑制劑TBB，能誘導Jurkat細胞的凋亡。另外，這可能與凋亡基因Capse家族有關（Caspse家族是CK2的底物之一）。有研究發現，CK2的抑制劑——槲皮素、芹黃素、楊梅黃酮能夠通過刺激Caspse3和Caspse9的活性而誘導HL-60細胞的凋亡［10］。相信，隨著研究的進一步深入，將對指導臨床對白血病的治療產生重要的現實意義。

參考文獻

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［6］李春梅，劉新光，林小聰，等. 3，6-二羥黃酮對重組人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其動力學分析［J］.中國藥學雜志，2004，39（12）：903-906.

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［9］Ruzzene M，Penzo D，Pinna LA.Protein kinase CK2 inhibitor 4，5，6，7tetrabromobenzotriazole (TBB) induces apoptosis and caspasedependent degradation of haematopoietic lineage cellspecific protein 1(HS1) in Jurkat cells［J］.Biochem J，2002，364(Pt 1):41-47.

［10］黃華藝，查錫良.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展［J］. 中國新藥與臨床雜志，2002，21(7)：428-433.

(收稿日期：2008-01-16 修回日期：2008-03-21)

(編輯：梁明佩 英文審校：唐雄林)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。