全硫代反義寡核苷酸抑制人膀胱癌Ｅｊ細胞活性的實驗研究

【摘要】 目的 研究全硫代反義寡核苷酸（PSASODN）對人膀胱癌細胞Ej端粒酶活性及細胞生長的影響，探討PSASODN在膀胱癌治療中的價值，為臨床治療膀胱癌提供理論依據。方法 將PSASODN 轉染作用于人膀胱癌細胞Ej中，分別采用MTT法、流式細胞術、酶聯免疫吸附( ELISA) 法檢測不同濃度PSASODN對人膀胱癌細胞Ej的細胞增殖、細胞凋亡和端粒酶活性的作用。結果 PSASODN作用于人膀胱癌細胞Ej后能顯著抑制人膀胱癌細胞Ej的端粒酶活性，抑制癌細胞生長增殖，促進細胞凋亡，而且呈現時間特異性和劑量依賴性，與SODN 轉染組及空白對照組進行比較，差異顯著(P＜0.05或0.01)。結論 PSASODN能抑制人膀胱癌細胞Ej的生長，降低其端粒酶活性并誘導細胞凋亡；抑制端粒酶活性可能成為膀胱癌基因治療的新靶點。

【關鍵詞】 全硫代反義寡核苷酸；膀胱癌；端粒酶

文章編號：1003-1383(2008)02-0130-03中圖分類號：R 737.14文獻標識碼：A

Inhibitory effects of the proliferation of human bladder carcinomaEj cell by antisense phosphorothioate oligonucleotide [HJ1*2]

GUO Wei1，CHEN Meini2，FENG Jizhou1

(1. Department of urinary surgery， affiliated hospital of Yan'an University， Yan'an， 716000；2. Medical college of Yan'an University， Yan'an， 716000)

【Abstract】 Objective To study the effects of antisense phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (PSASODN) on telomerase activity and proliferation of bladder carcinoma Ej cell， and explore the treatment value of PSASODN for bladder cancer.

Methods PSASODN was transfected into bladder cancer cell line Ej by liposomal transfection. Effects of different PSASODN density on proliferation activity of cell proliferation， cell withering， activity of telomerase of Ej were examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)， flow cytometermethod and ELISA.Results Telomerase activity of Ej cells， transfected with PSASODN， was significantly inhibited， compared with that of control groups and nonsense oligonucleotide (SODN) transfected cells (P＜0.05 or 0.01)，and showed no difference between the latter two groups (P＞0.05). Inhibitory effect of PSASODN was showed in a dose and timedepended manner. The proliferation of Ej cells transfected with ASODN undergoing apoptosis was statistically lower than that of control groups (P＜0.05).

Conclusion PSASODN can inhibit the growth of Ej Cells and decrease telomerase activity， causing the revulsion of cell withering. The results suggested that inhibition of telomerase activity would be a new target to treatment for bladder cancer.

【Key words】 antisense phosphorothioate oligonucleotide；bladder cancer; telomerase 

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤。端粒酶抑制劑能夠抑制端粒酶的活性，使腫瘤細胞完全失去增殖能力，趨于分化和凋亡，成為研究熱點之一。本文擬通過觀察針對端粒酶模板設計的全硫代反義寡核苷酸(PSASODN) 對人膀胱癌Ej細胞端粒酶活性的影響，為膀胱腫瘤基因治療臨床應用提供新的基因靶點。

材料與方法

1.材料 人膀胱癌細胞株Ej(上海細胞庫)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(SIGMA公司)； PSASODN序列為5’CTCAGTTAGGGTTAGACA-3’，PSSODN序列為5’CATTTCTTGCTCTCCACG3’，均為全硫代修飾型(上海生工生物工程公司)；脂質體(Beyotime Biotechnology公司)；半定量端粒酶檢測試劑盒(大連泛邦生物公司)；離心機(上海安亭儀器廠)；流式細胞儀(美國Coulter公司)； Biocellhtl型全自動酶標儀(南京華東公司)。

2.方法(1)細胞培養 膀胱癌細胞Ej以5×104/ml密度接種在含10%新鮮胎牛血清、100 U/ml慶大霉素的RPMI-1640 培養液中，置37℃、5% CO₂孵箱中培養，隔天換液一次，取對數生長期細胞用于實驗。

(2)細胞轉染 脂質體介導的全硫代反義寡核苷酸轉染按說明書操作。實驗分5組，每組設6個復孔。5組分別為

終濃度為5 μmol/L，3 μmol/L 及1 μmol/L 的ASODN組，終濃度為 5 μmol/L的SODN組以及正常對照組(僅加培養液)。用藥后將小牛血清的濃度調至5%，以減少寡聚脫氧核苷酸的降解。24 h后棄去轉染液，換新鮮培養液，并繼續培養，收集細胞備用。

(3)MTT法檢測細胞生長抑制率 細胞以5×104 /ml密度接種在96孔培養板上，每孔100 μl，待細胞生長活躍時加處理因素，分組同細胞轉染。分別培養24 h、48 h、72 h 后檢測。檢測方法：每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續培養4 h，翻板倒掉液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，輕輕振蕩10 min，用自動酶標儀檢測540 nm處的吸光度(OD) 值。計算細胞生長抑制率。抑制率（％）＝(空白對照組平均OD值-PSASODN組平均OD值)/空白對照組平均OD值。

(4)端粒酶活性檢測 取處理因素作用24 h、48 h、72 h后的細胞104個，PBS洗滌后離心去上清，加裂解液10 μl，冰浴放置30 min，4℃、15000 rpm 離心10 min，取上清液保存于-80℃，以備端粒酶活性檢測。按試劑盒說明書操作，檢測每組在450 nm處的OD值，并計算相應的端粒酶活性。Index=樣品的OD值/ 標準液的OD值。結果判斷:Index≥1為+；Index在0.91～0.99為+/-；Index≤0.90為-。

(5)流式細胞儀檢測 取處理因素作用24 h、48 h、72 h后的細胞10⁶個，70%酒精固定24 h，冷PBS洗滌3次，15000 rpm離心10 min，棄上清，碘化丙啶避光染色30 min，上機測試細胞凋亡。

3.統計學處理 計量資料以-±s表示，用SPSS 11.5軟件包處理，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。

結果

1.MTT檢測結果 5 μmol/L，3 μmol/L及1 μmol/L的PSASODN 轉染Ej細胞后24 h，對細胞增殖無明顯抑制，與對照組比較(P＞0.05)；48 h能夠抑制細胞增殖，與對照組比較(P＜0.05)，并呈劑量依賴關系；72 h與對照組比較能夠顯著抑制細胞的增殖 (P＜0.01)，并呈劑量依賴關系。表明對Ej細胞活性的影響在48 h左右開始起作用，呈劑量和時間依賴性(表1)。

2.PSASODN對膀胱癌細胞Ej端粒酶活性的影響 作用24 h、48 h的各組細胞端粒酶活性均為陽性。72 h檢測結果表明：5 μmol/L的SODN轉染的Ej細胞端粒酶仍表現為陽性；ASODN轉染Ej細胞后，端粒酶活性顯著降低，呈劑量依賴性(表2)。

討論

端粒酶是控制腫瘤細胞增生及凋亡的重要調控物質之一［1］，高活性的端粒酶是腫瘤細胞無限增殖的必需條件之一，而在多數正常的體細胞中卻缺乏活性，因此抗端粒酶療法具有特異性高，選擇性強等特點，逐漸成為治療腫瘤的熱點［2，3］。全硫代修飾的反義核酸溶解性好，不易被核酸降解，半衰期長，作用持久的特點，更適于臨床應用［4］。脂質體為非毒性載體，無插入突變危險，將核酸導入細胞后即被降解，無毒物免疫原性，效率高，特異性強，具有良好的應用前景［5］。

研究表明，用反義hTR轉染HeLa細胞，端粒酶活性明顯降低，端粒縮短［6］。國內學者的研究也證實端粒酶反義核酸能抑制多種癌細胞的端粒酶活性［7～9］。該點在本研究中同樣得到證實，人膀胱癌細胞Ej細胞經端粒酶PSASODN作用后，端粒酶活性受到抑制，而PSSODN對人膀胱癌細胞Ej細胞的端粒酶無抑制作用，提示PSASODN對細胞端粒酶活性的抑制作用是序列特異性的，這種作用表現為劑量依賴性和時間依賴性。端粒酶活性與細胞增殖有關［10］，而且這種端粒酶活性抑制所誘導的凋亡是p53非依賴的，可能是端粒酶活性抑制后影響到染色體的穩定性，由此激發某種非p53依賴的信號系統從而誘導了凋亡［11，12］。caspase家族也可能參與了端粒酶RNA組分的反義寡核苷酸所誘導的凋亡［13］。本實驗結果也顯示PSASODN轉染人膀胱癌細胞Ej細胞后，不僅端粒酶活性下降，細胞生長抑制，凋亡明顯，而且呈現出劑量依賴性和時間依賴性。

本實驗為臨床應用PSASODN治療膀胱癌提供了理論依據。但是端粒酶抑制劑對生殖細胞、造血干細胞等端粒酶表達陽性的正常細胞也可能產生毒副作用。因此，此療法應用于膀胱癌的臨床治療尚需進一步的研究和探索。

參考文獻

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(收稿日期：2008-02-13 修回日期：2008-04-12)

(編輯：梁明佩 英文審校：唐雄林)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。