一種從果樹成熟葉片提取ＤＮＡ的方法

摘 要：針對(duì)果樹成熟葉片富含多糖、多酚及其它次生代謝物質(zhì)的特點(diǎn)，以8個(gè)果樹樹種的秋季成熟葉片為材料，采用改進(jìn)的CTAB法對(duì)其基因組總DNA進(jìn)行了提取，并對(duì)得到的DNA進(jìn)行了電泳檢測(cè)、含量測(cè)定和AFLP分析。結(jié)果表明，該方法從8種果樹的成熟葉片中均能提取出基因組總DNA，且DNA的純度和完整性都較好，D_[260mm，D_[280mm]的比值均在1.8-2.0之間，無降解現(xiàn)象。RNA去除干凈，能被限制性內(nèi)切酶完全消化；其AFLP分析(引物組合為EeoRI-TAIMseI-CTT，EcoRI-TT/MseI-CTT)條帶清晰，多態(tài)性好。說明此方法提取的果樹成熟葉片基因組總DNA完全適于AFLP分析。

關(guān)鍵詞：果樹：DNA提取；成熟葉片

中圖分類號(hào)：S66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2008)01-122-04

制備高質(zhì)量的基因組總DNA是進(jìn)行分子標(biāo)記、基因克隆、基因組文庫和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等果樹分子生物學(xué)研究工作的前提條件。目前，關(guān)于各種果樹基因組DNA提取方法雖有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但大多以幼嫩組織或器官為試材。而在我國以成熟葉片為材料，且同時(shí)適用多種果樹的提取方法報(bào)道較少。為此，針對(duì)果樹成熟葉片富含多糖、多酚及其它次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，在桃成熟葉片^[1]提取成功的基礎(chǔ)上。又對(duì)其它果樹基因組總DNA的提取進(jìn)行了研究，并對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行了紫外、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及AFLP分析驗(yàn)證，成功地獲得了高質(zhì)量的8個(gè)果樹樹種秋季成熟葉片DNA提取方法，為秋季無法獲得幼葉等其它幼嫩材料時(shí)從事果樹基因組研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

桃、蘋果、杏、葡萄、李、櫻桃、梨和草莓等8種果樹的秋季(10月中旬)成熟葉片(表1)，均采自北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，首先將其放入冰壺中帶回實(shí)驗(yàn)室，然后再用清水沖洗吸干后置于硅膠中干燥保存?zhèn)溆谩Ｃ繕浞N隨機(jī)取2個(gè)品種的成熟葉片用于DNA提取純度、產(chǎn)率及完整性比較研究。

1.2 主要試劑及儀器

CTAB、SDS、葡萄糖、PVP、β－巰基乙醇、EDTA、Tris和dNTPs均購于上海生物工程公司，用于AFLP反應(yīng)的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增引物也由上海生物工程公司合成；Tris飽和酚和Taq酶購自華美生物工程公司：其它試劑為國產(chǎn)分析純。所用離心機(jī)為Ep－pendoff5415D型：恒溫水浴鍋為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司DK-S²⁴型；紫外可見分光光度計(jì)為上海天美科學(xué)儀器有限公司UV-Vis8500型：瓊脂糖凝膠電泳儀為北京市六一儀器廠DYY-6C型；PCR儀為美國MJ公司PTC-100型；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為Bio-rad公司PAC-3000型。電泳槽為C.B.S.公司DH-400-33型。

1.3 成熟葉片DNA提取方法及步驟

除去中脈的果樹成熟葉片0.25 g放人充分預(yù)冷的研缽中。加入液氮迅速研磨至粉末狀后，立即裝入含有1.2mL預(yù)熱的3％CTAB裂解液[100mlnol/LTris-HCl(pH 8.0)、20 mmmol/L EDTA(pH 8.0)、1.4 mol/LNaCl、3％CTAB(M/V)、2％PVP(M/V)、5％β-巰基乙醇(V/V)1，懸浮沉淀，65℃水浴5 min后，常溫下10000 r/min離心10min；棄去上清液，再加人1.2mL提取緩沖液[0.7mol/L NaCl、0.4 mol/L葡萄糖，3％可溶性PVP(M／V)、5％β一巰基乙醇(V，v)]的2.0 mL離心管中，搖勻后，靜置10 min，10 000 r/rain常溫離心10 min；棄去上清液后，加入l mL預(yù)熱的3％CTAB裂解液[含2％β-巰基乙醇(V/V)]懸浮沉淀，65℃溫浴1 h，其間顛倒混勻3次；水浴后，加入1/4體積的無水乙醇，輕輕混勻，再加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1，V/V)，上下顛倒混勻，常溫下靜置抽提10min，12 000 r/min離心15min；取上清液，加入1/10體積預(yù)熱的CTAB/NaCl[0.7 mol/L NaCl、10％CTAB(M/V)]溶液，混勻后再加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1，V/V/V)，輕輕顛倒混勻，靜置10r min.12 000 r/min，常溫離心15 rain；取上清液，再加入1/10體積預(yù)熱的CTAB/NaCl溶液，混勻后加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1，V/V)，輕輕顛倒混勻，靜置10min，12 000drain，常溫離心15 min；上清液轉(zhuǎn)入新的2.0 mL離心管中。加入1/2體積5 mol/LNaCI的溶液，混勻后再加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，20℃靜置30 min；12 000r/min常溫離心15 min，棄上清液；用75％Z~醇洗沉淀3次：室溫風(fēng)干2 h左右，加入550 ILL TE[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8/0)、1.0 mol/L EDTAfpH8.0)]緩沖液，充分溶解后，加10g/L的RNase 1μL，37℃溫浴1 h，再加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1，V/V)，輕輕混勻，12 000 r/min常溫離心15 min；取上清液，加入1/10體積3 mol/L NaAc(pH 5.2)溶液和2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃靜置30 min：12 000 r/min常溫離心15 min。棄去上清液；用75％乙醇洗沉淀3次；室溫風(fēng)干2 h左右，溶于適量的TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的檢測(cè)方法

1.4.1 DNA純度和產(chǎn)率檢測(cè)DNA樣品按一定倍數(shù)(15-40倍)稀釋后，測(cè)定其在260 am和280 nin處的紫外吸收值，計(jì)算出D₂₆₀D₂₈₀的比值，若D_260mm/D_{280值介于1.8-2.0之間，則表明DNA純度較好。按照1個(gè)D280值相當(dāng)于50 ng/μL，和稀釋倍數(shù)來換算DNA的濃度，并計(jì)算DNA的產(chǎn)率。}

1.4.2 DNA的完整性檢測(cè) 取2 txL DNA提取原液，加3μL上樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)、40％蔗糖)，在0.7％瓊脂糖凝膠[含0.5 mg/L的EB(溴化乙錠)]中電泳，電泳緩沖液為1xTAE，電壓為110V，電泳大約50 rain后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)其完整性及RNA去除情況，并拍照。

1.4.3 AFLP分析模板DNA的限制性酶切和接頭連接。按照Lifetechnologies公司的AFLP核心試劑盒(Cat.No.:10482-016)產(chǎn)品說明書進(jìn)行；預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)、選擇性擴(kuò)增、PAGE電泳及銀染檢測(cè)參考吳俊等^[2]提供的方法來操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個(gè)樹種成熟葉片DNA純度和產(chǎn)率的測(cè)定

從8個(gè)樹種成熟葉片基因組DNA的紫外分析結(jié)果(表2)可以看出，改進(jìn)CTAB法從8種果樹中均提取出了高質(zhì)量的基因組DNA。每一樣品的D_260mmD_280mm比值都介于1.8-2.0之間，且提取的DNA均為白色絮狀沉淀，溶液清亮，無黏稠感，說明DNA樣液中基本無蛋白質(zhì)、RNA、多糖和酚類等雜質(zhì)的污染，純度較好；但就DNA的產(chǎn)率而言，不同材料的成熟葉片DNA的產(chǎn)率差異較大，最高達(dá)71.60μg/g，最低僅為7.65μg/g，究其原因可能是因?yàn)椴煌牧祥g在多糖、蛋白質(zhì)等次生物質(zhì)含量上的不同，或單位質(zhì)量的成熟葉片所具有的細(xì)胞數(shù)目不同，導(dǎo)致了DNA含量在不同材料間存在著差別。

2.2 8個(gè)樹種成熟葉片DNA的電泳檢測(cè)

8個(gè)樹種成熟葉片DNA提取原液的瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1所示，由圖中可以看出，8種果樹成熟葉片DNA的樣品孔均不發(fā)亮，且DNA主帶清晰，無彌散帶。無明顯的RNA帶，說明多糖、RNA及其它次生物質(zhì)等雜質(zhì)去除的比較干凈，純度較高，完整性也較好。但在亮度上，各樹種間及同一樹種不同品種間都不同程度地存在差異，與紫外分光光度計(jì)的定量分析結(jié)果相一致。

2.3 AFLP驗(yàn)證分析

為了驗(yàn)證改進(jìn)CTAB法對(duì)果樹成熟葉片提取DNA的效果，將提取的16個(gè)DNA樣品以50 mg/LkDNA為對(duì)照，通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA的提取原液稀釋定溶至50 mg/L，在引物組合EcoRI-TA/MseI-CTT和EcoRI-TUMseI-CTF下進(jìn)行AFLP反應(yīng)(圖2)。從圖2中可看到，8種果樹DNA的AFLP分析結(jié)果帶紋清晰，分布均勻，多態(tài)性好；在不同材料間和不同引物組合下都能夠得到穩(wěn)定、清晰、分辨率高的指紋圖譜。也由此進(jìn)一步證明，改良CTAB法提取的8種果樹成熟葉片基因組DNA質(zhì)量好，純度高，基本滿足AFLP分析的要求。

3 討論

許多針對(duì)基因組進(jìn)行的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(如AFLP分析。分子雜交等)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求都較高，而果樹葉片中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、多酚和色素類等次生代謝物質(zhì)，且葉片越老，這些物質(zhì)含量就越高，尤其是多糖，這無疑給果樹成熟葉片DNA的提取帶來了一定難度。多糖類物質(zhì)易與DNA形成黏稠的膠狀物，給DNA的分離和純化帶來困難；多酚類物質(zhì)不僅極易被氧化褐變，而且還可抑制TaqDNA聚合酶的活性，從而影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)^[2]。

在本試驗(yàn)的最初階段，我們?cè)锰页墒烊~片DNA提取方法^[1]來提取其它7種果樹成熟葉片中的DNA，但結(jié)果在草莓、梨、櫻桃上提取的DNA均呈黏稠狀，難以溶于TE緩沖液中，且葡萄還為淺褐色沉淀，為了有效的去除多糖和多酚類等物質(zhì)的干擾，我們?cè)诖朔椒ǖ幕A(chǔ)上又做了進(jìn)一步的改進(jìn)。將干葉磨成粉末后，首先加人CrAB裂解液，在65℃水浴中作用5 min。然后再用提取緩沖液洗滌1次，利用CTAB在高離子強(qiáng)度的溶液里(>0.7 mol/LINaCl)，易與蛋白質(zhì)、大多數(shù)多糖形成復(fù)合物^[4]，及0.7 mol/L的NaCl對(duì)多糖類物質(zhì)的溶解作用^[3]，明顯地降低了多糖類等雜質(zhì)對(duì)DNA提取的影響；CTAB裂解液和提取緩沖液中的5％β-巰基乙醇對(duì)酚類物質(zhì)氧化的抑制作用^[6]，再加上提取緩沖液中3％的可溶性PVP與酚類物質(zhì)的結(jié)合作用^[7]，也有效地去除了多酚類物質(zhì)對(duì)DNA提取的干擾，這是提取過程中的關(guān)鍵步驟，若缺少此步驟，用酚、氯仿、異戊醇、NaCl和乙醇等物質(zhì)多次抽提或沉淀，也很難達(dá)到完全去除多糖類物質(zhì)污染的目的。隨后又加入了1/4體積的無水乙醇進(jìn)行抽提。因?yàn)榈蜐舛鹊囊掖?0％-30％)可沉淀勻漿上清液中的多糖^[8]，但同時(shí)也會(huì)使DNA的產(chǎn)率下降，此步對(duì)桃、李、杏和蘋果并非必需。在氯仿，異戊醇(24:1)及酚，氯仿，異戊醇(25:24:1)抽提過程中加入的1/10體積CTAB/NaCl溶液，不但進(jìn)一步降低了多糖類物質(zhì)對(duì)DNA提取的影響^[3]，而且使酚、氯仿對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的萃取更加徹底，并可用酚或氯仿抽提去除^[4]。在氯仿，異戊醇(24:1)抽提后的水相中加入1/2體積5 mol/L的NaCl溶液，可使殘留的多糖類等物質(zhì)充分溶解，隨后加入的乙醇，可選擇性沉淀DNA，而多糖仍留在上清液中^[9]，進(jìn)而達(dá)到了分離純化DNA的目的。

總之。本方法所提取的8種果樹的基因組DNA，純度較高，完整性較好，AFLP分析結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，說明這種提取果樹成熟葉片的改進(jìn)方法是有效的。