魚類胰彈性蛋白酶的研究進(jìn)展

摘要：本文綜述了國(guó)內(nèi)外魚類胰彈性蛋白酶的分離純化、特性研究和系統(tǒng)發(fā)育分析。闡明了魚類胰彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，有助于了解魚類的消化生理特點(diǎn)，為水產(chǎn)飼料的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：魚類；絲氨酸蛋白酶；彈性蛋白酶；分離純化；系統(tǒng)發(fā)育分析

胰液中含有三種肽鏈內(nèi)切酶，分別是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，是一種消化酶，在魚類食物蛋白質(zhì)的消化過(guò)程中承擔(dān)著重要的生理功能。彈性蛋白酶以水解不溶性彈性硬蛋白（Elastin）為特征，專一性裂解丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等小的中性氨基酸殘基羧基側(cè)鏈與其他氨基酸的氨基所形成的肽鍵，具有廣泛的水解蛋白活性。

彈性蛋白酶主要存在于動(dòng)物胰臟，在皮膚、主動(dòng)脈、血小板、白血球中也有存在。魚類胰彈性蛋白酶主要來(lái)源于肝胰臟、腸道和幽門盲囊。結(jié)構(gòu)上，彈性蛋白酶原與胰凝乳蛋白酶原等胰絲氨酸蛋白酶相似，均具有一條信號(hào)肽、一條激活肽和一條成熟肽，功能蛋白通過(guò)信號(hào)肽形成。胰彈性蛋白酶的激活與失活都受胰蛋白酶調(diào)節(jié)，彈性蛋白酶原在胰腺中合成，并以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中酶原被胰蛋白酶從肽鏈N端斷開肽鍵，失去一段短肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘膹椥缘鞍酌浮１疚木C述國(guó)內(nèi)外魚類胰彈性蛋白酶分離純化、特性研究、氨基酸組成以及序列分析等方面的研究工作，進(jìn)一步闡明魚類消化生理機(jī)制，為水產(chǎn)飼料的配制研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1魚類胰彈性蛋白酶的分離純化研究

科學(xué)家已經(jīng)成功分離出了許多哺乳動(dòng)物的胰彈性蛋白酶，例如豬、鼠及人類，并在此基礎(chǔ)上開展了大量研究工作。有關(guān)魚類胰腺絲氨酸蛋白消化酶的研究也有報(bào)道，但有關(guān)魚類彈性蛋白酶的研究不多，而且國(guó)外要比國(guó)內(nèi)開展得早且深入。已有研究報(bào)道了非洲肺魚、鯉魚、鯰魚、鱈魚、金槍魚、虹鱒魚、角鯊、大西洋鮭胰彈性蛋白酶純化和鑒定工作。國(guó)內(nèi)外魚類胰彈性蛋白酶分離純化工作，主要集中在海水魚類，少有淡水魚類。

胰彈性蛋白酶的分離純化遵循蛋白質(zhì)分離純化的一般原則。總純化程序可以分為三步：組織樣品前處理、粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離，主要是利用蛋白質(zhì)之間特異性的差異進(jìn)行分離，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。常用的分離純化方法和技術(shù)有：沉淀法（鹽分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等）、離心、透析、層析法等等。粗分級(jí)分離是用鹽析和離心等簡(jiǎn)單的分離方式獲得粗品，后期細(xì)分級(jí)分離獲得純品時(shí)偏向于用層析法，其中較為經(jīng)典的方法為凝膠過(guò)濾層析法，離子交換層析法和親和層析法。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析可脫去鹽等小分子雜質(zhì)。離子交換層析一般是進(jìn)行陰離子交換，因?yàn)轸~類胰彈性蛋白酶在中性及堿性溶液中一般以陰離子形式存在。親和層析一般采用胰彈性蛋白酶抑制劑作為親和配體，主要采用親和層析，填料為Sepharose-4B。如Gunnar I.Berlund等從大西洋鮭魚幽門盲囊組織中純化彈性蛋白酶的過(guò)程為：用p-aminobenzamidine-Sepharose -6B層析柱去除粗提取液胰蛋白酶，超濾膜濃縮流出液后過(guò)phenyl- Sepharose-6 FF層析柱、過(guò)Q-Sepharose FF離子交換柱、過(guò)SP-Sepharose FF離子交換柱、過(guò)銅離子螯合柱去除胰凝乳蛋白酶、最后過(guò)Superdex 75凝膠過(guò)濾層析柱，完成最后一步精細(xì)純化獲得蛋白酶純品。

2魚類胰彈性蛋白酶的特性研究

在國(guó)內(nèi)，江信紅等從黃鱔腸道分離純化出三種具有彈性蛋白酶活性的同工酶。謝一榮等研究了魚類彈性蛋白酶等主要消化酶在組織器官中的分布。在國(guó)外，有關(guān)彈性蛋白酶的研究較國(guó)內(nèi)多且深入。Gildberg A等（1990）分離純化北大西洋鱈魚的胰彈性蛋白酶，并就底物特異性、催化效率和穩(wěn)定性與豬的胰彈性蛋白酶做了比較研究。Smine A等（1995）從角鯊胰提取物中純化鑒定了胰彈性蛋白酶的兩種亞型，EI和EII。兩種酶在37℃均對(duì)彈性蛋白酶特異性高敏感底物琥珀酰（丙氨酸）3對(duì)硝基苯胺（Suc-AAA-pNA）表現(xiàn)出高度的催化活性，但卻具有不同的催化參數(shù)。Berglund GI等（1998）從北大西洋鮭魚的幽門盲囊純化鑒定了胰彈性蛋白酶，對(duì)該酶的生物學(xué)特性和動(dòng)力學(xué)特性做了深入研究，同時(shí)與豬的胰彈性蛋白酶性質(zhì)做了比較。Ulitina NN等（2005）首次從歐洲鲇魚中分離純化了三種絲氨酸蛋白消化酶，包括三種胰蛋白酶的亞型，三種胰凝乳蛋白酶的亞型和兩種彈性蛋白酶的亞型。Sakharov IIu等利用離子交換層析法和凝膠過(guò)濾層析法從中國(guó)鱟的肝胰腺純化出對(duì)特異底物Boc-（Ala）3-pNA具有高度催化活性的彈性蛋白酶，這也是最早有關(guān)從甲殼動(dòng)物中分離純化出彈性蛋白酶的研究報(bào)道。

2.1pH值和溫度對(duì)胰彈性蛋白酶的影響

據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究，魚類胰彈性蛋白酶一般在pH值為5.0～9.0的條件下非常穩(wěn)定。pH值對(duì)彈性蛋白酶活力的影響可通過(guò)水解琥珀酰（丙氨酸）3對(duì)硝基苯胺（Suc-AAA-pNA）的催化效率來(lái)測(cè)定。將魚類和豬的胰彈性蛋白酶做比較，科研人員發(fā)現(xiàn)兩種酶均在較廣的pH值范圍內(nèi)保持了催化能力，但是魚類耐受酸的能力較差。有個(gè)別種屬表現(xiàn)出突出的酸堿耐受能力，如北大西洋鮭魚在pH值為4.0～11.0的條件下仍具有較高的催化活性。大部分魚類彈性蛋白酶在pH值低于4.0的酸性條件下變得不穩(wěn)定，有個(gè)別種在pH值低于7.0時(shí)穩(wěn)定性降低，如大西洋鮭魚的最適pH值在為8.0～9.5，當(dāng)pH值<4.0時(shí)酶活性明顯降低，可見魚類胰彈性蛋白酶大都呈中性或弱堿性。同屬不同種的魚類的酶適宜pH值有時(shí)也存在明顯差異，就是同一種魚的酶活性在不同的pH值條件下也會(huì)有所差異，pH值是影響消化酶活性的關(guān)鍵因素之一。

溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素，溫度的變化影響酶活力。魚類生活環(huán)境的差異即所在環(huán)境溫度的變化，對(duì)酶的活力也相應(yīng)地發(fā)生影響。一般而言，魚類消化酶活力的最適溫度均高于其所處的環(huán)境溫度。魚類胰彈性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度在30～60℃范圍內(nèi)，這與大多數(shù)消化酶適宜的溫度范圍相一致，如鱈魚彈性蛋白酶在45℃反應(yīng)溫度下針對(duì)Suc-AAA-pN表現(xiàn)出最高催化效率，但是彈性蛋白酶穩(wěn)定溫度范圍與其最適反應(yīng)溫度是不同的，為了研究酶對(duì)溫度（22～75℃）的耐受力，將鮭魚和哺乳動(dòng)物的彈性蛋白酶分別在一定的pH值（2.0～10.5）條件下溫浴10分鐘，隨即在冰上冷卻，然后在pH值為2.0和22℃條件下用人工底物測(cè)殘留酶活力，發(fā)現(xiàn)鮭魚彈性蛋白酶在所有上述pH值條件下，活性較哺乳動(dòng)物彈性蛋白酶低；兩種酶在中性和堿性條件下均比酸性條件下對(duì)溫度的耐受力要高。

2.2胰彈性蛋白酶底物專一性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)及比較研究

底物濃度對(duì)胰彈性蛋白酶水解速度的影響可用米氏常數(shù)（Km）來(lái)表示。它是酶的特征性常數(shù)，Km值越小，酶與底物的親和力越大。將來(lái)自于鼠、豬、鮭魚的胰彈性蛋白酶做比較，水解一系列人工底物Suc-AAPX-pNA（X=a-氨基酸）。結(jié)果表明，魚類彈性蛋白酶針對(duì)P1位置表現(xiàn)出亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等氨基酸偏好性。將來(lái)自于鮭魚、鱈魚、虹鱒魚、金槍魚、豬、鼠的胰彈性蛋白酶做比較，水解人工底物Suc-AAA-pNA，其中Km值（mM）分別為1.47、1.02～1.96、2.2、1.2、2.99、1.09～2.0。Kcat值（S-1）分別為3.5、38.5～44.5、184、4.16、2.8、1.59～6.2。Kcat/Km值分別為2.4、19.6～43.2、83.6、3.5、0.9、1.46～3.1。綜合上述數(shù)據(jù)，可知同樣條件下測(cè)得的鮭魚、鱈魚、虹鱒魚、金槍魚胰彈性蛋白酶的Km值相近，卻比豬的Km值小了近一倍，鮭魚胰彈性蛋白酶Kcat值（轉(zhuǎn)化率）較豬的胰彈性蛋白酶Kcat值高，從而Kcat/Km值（催化效率）比豬的胰彈性蛋白酶Kcat/Km值高了2.5倍。結(jié)果表明，四種魚類胰彈性蛋白酶與底物Suc-AAA-pNA的親和力相近，但要比豬胰彈性蛋白酶的底物親和力小；大西洋鮭魚彈性蛋白酶作為一種適冷酶為了適應(yīng)低溫的生活環(huán)境，催化效率是豬的胰彈性蛋白酶的2.5倍。綜合來(lái)自魚類和哺乳動(dòng)物的胰彈性蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，盡管催化效率各不相同，但魚類胰彈性蛋白酶擁有比哺乳動(dòng)物胰彈性蛋白酶更高的催化效率。

2.3抑制劑影響胰彈性蛋白酶活力的研究

胰彈性蛋白酶的抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，是一種能夠降低胰彈性蛋白酶活力的物質(zhì)。以大西洋鮭魚，鱈魚和角鯊為例，其彈性蛋白酶活性能被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氯（PMSF）、抑彈性蛋白酶醛（Elastatianl）和MPCMK強(qiáng)烈抑制，表現(xiàn)出絲氨酸蛋白酶家族成員的共有特征。但是苯甲脒、牛胰蛋白酶抑制劑（BPTI）和亮肽素等胰蛋白酶特異性抑制劑對(duì)大西洋鮭魚胰彈性蛋白酶活力卻無(wú)明顯影響，這又表現(xiàn)出彈性蛋白酶與其他絲氨酸蛋白酶家族成員的性質(zhì)差異。

L-半胱氨酸，一種金屬離子螯合劑和巰基阻斷劑，對(duì)魚類和哺乳動(dòng)物胰彈性蛋白酶均有抑制效應(yīng)。但是二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA，對(duì)魚類和哺乳動(dòng)物胰彈性蛋白酶均無(wú)明顯抑制效應(yīng)。體現(xiàn)了不同種屬來(lái)源的胰彈性蛋白酶的共性。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)魚類胰彈性蛋白酶比哺乳動(dòng)物胰彈性蛋白酶對(duì)PMSF更敏感；碘乙酰胺，一種巰基改良劑，對(duì)魚類胰彈性蛋白酶無(wú)影響，卻對(duì)哺乳動(dòng)物胰彈性蛋白酶有輕微抑制效應(yīng)；大豆胰蛋白酶抑制劑能抑制鱈魚胰彈性蛋白酶活力，對(duì)豬胰彈性蛋白酶活力卻無(wú)影響。上述報(bào)道說(shuō)明，不同種屬來(lái)源的胰彈性蛋白酶對(duì)抑制劑的敏感程度不同，存在差異。

2.4胰彈性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的研究

魚類胰彈性蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量一般是通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定。硬骨魚類胰彈性蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為24-29KDa。Berglund GI等測(cè)得大西洋鮭的胰彈性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量為27 KDa、大西洋鱈魚24.8 KDa、歐洲鲇魚24 KDa、Dover sole19.5 KDa。甲殼動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和禽類的胰彈性蛋白酶分子質(zhì)量也在這個(gè)范圍，如測(cè)得中國(guó)鱟胰彈性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量為28.5 KDa，智人26.3 KDa，鼠29KDa，牛29 KDa，綿羊25 KDa，雞25 KDa。

總結(jié)許多學(xué)者的研究報(bào)道，魚類胰彈性蛋白酶的等電點(diǎn)一般在6～9.5范圍內(nèi)。如測(cè)得大西洋鮭的胰彈性蛋白酶PI大于9.3、大西洋鱈魚9.3、Dover sole 5.7。所以，在中性條件下，絕大部分胰彈性蛋白酶都屬于中性偏堿性蛋白酶，只有個(gè)別魚類胰彈性蛋白酶為弱酸性，如歐洲鲇魚胰液純化得出的兩種帶電不同的胰彈性蛋白酶亞型的PI分別為6.17/8.48，一種屬于堿性胰彈性蛋白酶，而另外一種屬于弱酸性胰彈性蛋白酶。

3胰彈性蛋白酶的序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

哺乳動(dòng)物包括豬、鼠、人的彈性蛋白酶氨基酸序列測(cè)定已經(jīng)完成，編碼區(qū)分別由266、266、269個(gè)氨基酸殘基組成，具有較高的同源性。魚類與哺乳動(dòng)物的胰彈性蛋白酶氨基酸組成存在相似性，但是無(wú)論是殘基數(shù)目還是組成上都存在差異。登陸GenBank能搜索到大西洋鮭魚和日本比目魚彈性蛋白酶編碼區(qū)完整序列信息，分別由181和266/268（EL1/EL4兩個(gè)亞型）個(gè)氨基酸殘基組成。將角鯊的兩種胰彈性蛋白酶亞型EI和EII的氨基端序列（各20個(gè)殘基）與人和鼠的胰彈性蛋白酶編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，具有85%的同源性。兩棲動(dòng)物中非洲爪蟾的編碼區(qū)由264個(gè)氨基酸殘基組成。

生物進(jìn)化分析是生物信息學(xué)的一個(gè)分支。它通過(guò)對(duì)生物序列的研究推測(cè)物種的進(jìn)化歷史。主要通過(guò)DNA序列，蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等來(lái)構(gòu)建分子進(jìn)化樹或者種系發(fā)生樹。將日本比目魚與其他硬骨魚如鱈魚、鮭魚和哺乳動(dòng)物如鼠以及人的胰絲氨酸蛋白酶基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化分析，從構(gòu)建的進(jìn)化樹得知日本比目魚胰蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶基因和彈性蛋白酶基因的首次倍增與硬骨魚、哺乳動(dòng)物胰絲氨酸蛋白酶基因構(gòu)成的簇的首次倍增發(fā)生在同時(shí)期。硬骨魚彈性蛋白酶基因與哺乳動(dòng)物彈性蛋白酶的分歧時(shí)間要晚于首次倍增。因此，可以得知胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的首次倍增早于硬骨魚類的分化。

4小結(jié)

彈性蛋白酶是廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、畜牧業(yè)和現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的一種非常重要的酶。目前，彈性蛋白酶主要作為治療高血脂癥、防止動(dòng)脈粥樣硬化的生化藥物。同時(shí)由于其廣譜的蛋白水解活性，不僅在醫(yī)藥工業(yè)，而且在食品工業(yè)、日化工業(yè)上也有著廣闊的應(yīng)用前景和較高的商業(yè)價(jià)值。較高活性胰彈性蛋白酶的提取利用，還有利于水產(chǎn)品加工過(guò)程中廢棄物的充分利用。在眾多蛋白質(zhì)水解酶中，胰彈性蛋白酶的年消耗量占酶制品世界市場(chǎng)的比例逐年上升。

胰彈性蛋白酶的純化及其特性的研究，不僅有助于了解胰彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，而且有助于探究魚類的消化生理特點(diǎn)，為水產(chǎn)飼料的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，為確立魚類適宜養(yǎng)殖條件提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但是到目前為止，魚類胰彈性蛋白酶的研究在國(guó)內(nèi)還處于剛剛起步的階段，迫切需要對(duì)胰彈性蛋白酶的基礎(chǔ)理論進(jìn)行更加深入透徹的研究，使該研究領(lǐng)域趕超世界先進(jìn)水平。