ＤｃＥＬＩＳＡ檢測(cè)泥鰍、鯽魚中氯霉素殘留方法的應(yīng)用

摘要：應(yīng)用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法（dcELISA）快速定量測(cè)定泥鰍、鯽魚肌肉中氯霉素（CAP）殘留量。氯霉素濃度在0.05～10ng/g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-0.33-1.88x，r2=0.995，向樣品中分別添加0.1、0.3、0.9ng/g三個(gè)濃度水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，泥鰍樣品的平均回收率分別為87.2%、88.9%、93.0%，鯽魚樣品的平均回收率分別為86.1%、79.9%、99.0%，最低檢測(cè)限為0.05ng/g，批內(nèi)變異系數(shù)為8.0%，批間變異系數(shù)為7.2%，結(jié)果表明該方法靈敏度高，重復(fù)性好，適合在泥鰍、鯽魚肉樣中氯霉素殘留篩選檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：氯霉素殘留；直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法；泥鰍；鯽魚

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）最初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌(Streptomyces Venezuela)的培養(yǎng)液中提取制得，是一類廣譜抗生素。氯霉素對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌具有明顯的抑制作用，氯霉素由于其優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性和廉價(jià)，曾是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗菌藥之一，長(zhǎng)期作為飼料添加劑和細(xì)菌性疾病的治療用藥[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)氯霉素存在著嚴(yán)重的毒副作用，易引發(fā)再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥以及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等[2]。因此，動(dòng)物性食品中的氯霉素殘留問(wèn)題一直備受關(guān)注，引起國(guó)際組織和世界上許多國(guó)家和地區(qū)的高度重視。中國(guó)農(nóng)業(yè)部已將氯霉素從2000年版《中國(guó)獸藥典》中刪除列為禁藥，而歐盟的進(jìn)口食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“氯霉素含量標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出。”[3]

目前，氯霉素殘留分析主要采用氣相色譜法和高效液相色譜法。高效液相色譜法雖然操作簡(jiǎn)單，但檢出限較高，無(wú)法滿足當(dāng)前對(duì)氯霉素低殘留限量的要求。氣相色譜法靈敏度較高，但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、分析速度慢、儀器價(jià)格昂貴，不適合在基層推廣使用[3-4]。自1984年Campbell等建立檢測(cè)CAP的ELISA以來(lái)，國(guó)外研究進(jìn)展較快，國(guó)內(nèi)研究相對(duì)滯后。隨著ELISA技術(shù)的發(fā)展直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（dcELISA）越來(lái)越體現(xiàn)出更多的優(yōu)勢(shì)，基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來(lái)的dcELISA，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以直接用于生產(chǎn)實(shí)踐，適用于大規(guī)模氯霉素殘留篩選檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料和儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀，產(chǎn)地：芬蘭；AL104電子天平，產(chǎn)地：上海；FSH-2可調(diào)高速勻漿器，產(chǎn)地：常州；DT5-1離心機(jī)，產(chǎn)地：北京；乙酸乙酯、正己烷，分析純，北京化學(xué)試劑公司；氯霉素、氯霉素堿、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等標(biāo)準(zhǔn)品，北京獸藥監(jiān)察所；氯霉素ELISA快速檢測(cè)試劑盒，北京中檢維康技術(shù)有限公司；生物樣品來(lái)源，市售。

1.2樣品的前處理

實(shí)驗(yàn)所采用樣品為泥鰍、鯽魚，分別取肌肉充分剪切、混勻，用高速組織勻漿器破碎，密封袋密封，標(biāo)記后－20℃保存。

稱取制備的樣品3g置50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振蕩器強(qiáng)烈混合10min；室溫3000g離心10min；取2ml上清液（相當(dāng)1g樣品）在50℃氮?dú)饬飨麓蹈桑挥?ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入1mlPBS緩沖液振蕩混合10min，室溫3000g離心10min；去上清液（正己烷），取100μl下層水相用于檢測(cè)。

1.3抗體交叉反應(yīng)的測(cè)定

抗CAP抗體抑制物分別采用倍比稀釋的氯霉素堿、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考，計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的IC₅₀， 比較抗體對(duì)它們的親合性。同時(shí)，用下式計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物與抗CAP 抗體的交叉反應(yīng)。

交叉反應(yīng)性（%）=IC50（CAP）×100/IC₅₀（競(jìng)爭(zhēng)物）

1.4分析程序

將所需的的微孔條插入微孔架，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做2 個(gè)平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入50μl 稀釋了的抗氯霉素抗體酶標(biāo)記物于微孔內(nèi)。充分混合，覆蓋上薄膜，室溫孵育1h。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打3次，完全除去孔中的液體，每次用250μl洗滌液洗板4次、排干。洗板后加入100μl底物到每個(gè)微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15min。加入50μl，2M H₂SO₄終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)量吸光度值（OD值）。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品濃度的計(jì)算

將所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值按下式折算成百分比吸光度值：

% 吸光度值 = 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的OD值 × 100 / 空白標(biāo)準(zhǔn)品的OD值

以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的 % 吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制對(duì)應(yīng)氯霉素濃度的半對(duì)數(shù)校正曲線，樣品濃度根據(jù)測(cè)得的OD值從校正曲線上讀出。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.4步驟，分別測(cè)定濃度為0、0.05、0.1、0.3、1、3、10ng/ml氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液的OD值，采用RIDASCREEN 數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1、圖2），由圖2曲線可知氯霉素濃度在0.05～10ng/ml范圍內(nèi)呈線性，線性方程為Y = -0.33-1.88X。相關(guān)系數(shù)：r = 0.997

2.2回收率

向樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的氯霉素標(biāo)樣：0.1、0.3、0.9ng/g，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，同時(shí)做4個(gè)空白樣。按1.2處理后測(cè)定氯霉素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。

2.3靈敏度

按照1.4步驟同時(shí)測(cè)定10個(gè)“0”標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值，求出其平均值（X），再減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)差（SD），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于OD值為X－2SD的濃度，即為靈敏度。該方法的平均靈敏度為0.05ng/g。

2.4精密度

采用變異系數(shù)表示法，在同一次測(cè)定中對(duì)3個(gè)濃度水平的樣品分別重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。分別測(cè)定3個(gè)濃度水平的樣品在3個(gè)不同批次測(cè)定之間的變異系數(shù)，即為批間變異系數(shù)。結(jié)果如表2所示。

2.5交叉反應(yīng)

CAP抗體與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3

3討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道的氯霉素的dcELISA針對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)是參照“雞肉和牛奶中氯霉素的提取方法”而建立的水產(chǎn)品中氯霉素提取方法[1-2]，結(jié)果表明dcELISA對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測(cè)方法靈敏度高，重復(fù)性較好，與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（icELISA）相比縮短了檢測(cè)時(shí)間和操作步驟，減少了操作誤差，更適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留的篩選[6]。與氣相色譜法相比，ELISA方法樣品處理簡(jiǎn)單方便，尤其適合大批量的檢測(cè)，并且成本低。因此采用dcELISA方法既可減小實(shí)驗(yàn)室的勞動(dòng)強(qiáng)度，又可節(jié)約檢驗(yàn)費(fèi)用，在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層檢測(cè)中有著廣闊的推廣應(yīng)用前景，是藥物殘留檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)。本方法在操作過(guò)程中應(yīng)注意的是加入正己烷溶解殘?jiān)倥cPBS混合時(shí)，劇烈的振蕩，易產(chǎn)生乳化，從而導(dǎo)致分離不徹底。另外，洗板也是本試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，如果是手工洗板，將洗板次數(shù)增加1～2 次，可提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。ELISA方法檢測(cè)結(jié)果往往會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此，慎重起見(jiàn)，對(duì)檢出的陽(yáng)性結(jié)果還需用氣相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

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