現代分子生物學技術在木霉鑒定及多樣性分析中的應用

董　楠　許艷麗

摘要木霉是一類重要的生防真菌，具有很大的農業應用潛力。對分離培養的木霉準確鑒定，對其在農業生產中的應用至關重要。近年來，分子生物學技術在木霉鑒定方面得到了廣泛應用，本文綜述了rDNA-ITS序列分析、通用引物PCR(UP-PCR)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態性(AFLP)等分子技術在木霉鑒定與多樣性分析中的應用。

關鍵詞木霉；DNA寡核苷酸條形編碼；UP-PCR；RAPDAFLP

中圖分類號S 154.3，Q 789

木霉屬真菌(Trichoderma spp.)是一類普遍存在的絲狀真菌，是土壤微生物的重要組成群落之一。該菌易于分離培養、生長迅速，能夠產生幾丁質酶、纖維素酶以及蛋白酶等多種酶類，能夠利用多種底物來抵抗某些有害化合物(氰化物等)的毒害。同時，木霉能夠拮抗多種農作物的病原菌、促進農作物生長、誘導其產生抗性，是一類重要的植物病害生防菌，具有極大的農業應用潛力。目前，全世界已有40多個國家開展了木霉的相關研究，已研制出50余種木霉的商品化生防菌劑；我國近年在該領域的研究與應用也取得了重要進展。

木霉屬真菌是一個龐大的家族，迄今已鑒定的超過100種，由于每種木霉在生防功能與代謝產物上都不盡相同，因此，對木霉進行準確鑒定和分類，對其在農業生產中的應用至關重要。傳統的生物學鑒定主要依據形態學方法，即根據屬間不同種的形態學和生殖器官分化特征來鑒定種。然而真菌的形態性狀復雜多變且易受環境影響，同一屬不同種的形態往往又極其相似，難以區分，這需要研究者具備豐富的形態學鑒定經驗。現代分子生物學方法的介入為木霉的鑒定及分類學研究開辟了一條新的途徑。人們在分子鑒定方面進行了許多嘗試，大大提高了鑒定效率及分類的準確性。本文就目前國內外分子生物學技術在木霉鑒定及多樣性分析方面的應用進行闡述，希望能為木霉的快速準確鑒定提供幫助。

1核酸序列分析與DNA寡核苷酸條形編碼的應用

核酸序列分析是通過測定基因中核苷酸序列的組成來比較同源分子間相關性的方法，是目前最常用的物種鑒定方法之一。由于某些基因的序列內部存在能夠闡明個體間遺傳關系的系統發育標記(能夠區別遺傳關系接近的基因片段，因此有的放矢地分析這些系統發育標記，能夠達到物種分類鑒定及多樣性分析的目的。Kopchinskiy等在NC—BI BLAST的基礎上開發了TrichoBLAST搜索工具(http：//www.isth.info/tools/blast/index.php)，是用于序列相似性研究的在線數據庫，專門用于木霉屬及其有性型肉座菌屬(Hypocrea spp.)物種的序列比對分析和鑒定。其中含有內轉錄間隔區(ITS區)、轉錄延伸因子I a亞基基因(tefl)及RNA聚合酶第二亞基(rpb2_exon)基因等3類木霉屬與肉座菌屬系統進化標記的數據信息。其中，ITS區(ITSl、5.8s和ITS2)既具保守性，又在科、屬、種水平上具有特異序列，一直被用于真菌的系統進化研究；tefl基因是編碼轉錄延伸因子I a亞基蛋白的基因，包括3個系統發育標記，分別是第4、第5內含子(4th、5th intron)和第6外顯子(6th ex—on)，這3個標記能夠不同程度地區分物種；rpb2基因也被用于微生物的分類研究中，但使用頻率不及前兩者高。

將待研究序列輸入TrichoBLAST程序中比對，系統將自動檢索未知序列中的系統發育標記，進而給出與已知序列具有不同相似程度的物種。這種方法簡單方便，但缺點是給出的結果是模糊的，需要研究者在比對結果的基礎上根據經驗進行判斷。

為克服這一問題，Druzhinina等在“DNA條形編碼”技術的基礎上，研究了用“DNA寡核苷酸條形編碼”(DNA oligonucleotide barcode)對木霉及肉座菌屬的菌株進行鑒定的方法，能夠給出確切的鑒定結果。DNA條形編碼(DNA barcoding)即應用單一片段基因序列來區分所有物種，達到物種鑒定的目的，如同超市中的條形碼，它隸屬于DNA分類的范疇，用于生物體分類及多樣性研究。自Hebert等提出這一理論以來，該技術已先后被應用于部分動物、原生動物以及昆蟲的鑒定與分類研究中。Druzhinina等第一次將該理論應用到真菌的研究中，他們是在考察了木霉與肉座菌屬88個菌株的979段序列，共計135個ITSl和ITS2單元型序列的基礎上研發出來的，就是應用ITS序列中不同位置上的幾段特異的寡核苷酸序列共同鑒定木霉/肉座菌屬菌株到屬、進化支及種的水平，并將不同的序列片段作為定義木霉屬及種的特異性標記，以條形碼的形式，存儲在MySQL數據庫中，形成TrichOKey v.1.0和2.0程序(www.isth.ifo.TrichOKey v.1.0/2.0)，在線就可查到。該方法能夠鑒定75個一元種(single species)，5個二元種(species pairs)以及1個三元種(speciestriplet)。使用這一程序不但能夠得到未知序列的鑒定結果，并對鑒定結果的可靠性進行評價(“high”或“lOW”)，還能夠獲得該種木霉的屬、進化支及種的特異性標記，為研究者設計特異性引物提供參考。應用該方法，作者選取本實驗室保存的20余株不同培養性狀的木霉進行鑒定，共鑒定出6個木霉種(T，har-zianum、T.viride、T.citrinoviride、T.virgns、T.aggressivum、T.pseudokoningii)；并根據特異性標記設計了木霉屬特異性擴增引物(未發表)。

作為一種分子鑒定手段，該方法的優點為：(1)快捷性：能夠給出確切的鑒定結果，這是它區別于BLAST的主要方面。(2)方便性：該程序充分考慮到使用者，即便使用者對木霉屬與肉座菌屬的分類情況知之甚少，也能夠方便地獲得鑒定結果，極大地提高了鑒定效率。(3)準確性：TrichOKey v.1.0/20數據庫中包含5個屬特異性標記及若干個種特異性標記，能夠使研究者從每一步來檢查結果的準確性。

2通用引物PCR結合交叉印跡雜交方法鑒定木霉屬真菌

通用引物PCR(Universally Primed PCR，UP-PCR)是一種PCR指紋圖譜技術，類似于RAPD(隨機擴增多態性DNA)技術，可用于基因組結構研究、物種鑒定、種間與種內遺傳關系分析以及種群多樣性研究，將其與SCAR(特異序列擴增)標記技術結合使用，可用于監測釋放到環境中的生防菌株。它的基本原理是根據聚合酶鏈反應(PCR)，用人工合成的一段16bp以上的通用引物，對待研究的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經聚丙烯

酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，形成PCR指紋圖譜，利用擴增產物多態性進行物種鑒定及多樣性分析。

由于木霉菌株擁有高度的基因組相似性，電泳后可以清晰地將種特異性條帶顯現出來，從而將不同種的木霉菌株分開，再將其指紋圖譜與已知種的圖譜進行比較，即可鑒定出未知菌株。如果指紋圖譜與參考菌株的條帶圖有很大差異，可以進一步結合交叉印跡雜交(cross blot hybridization)的方法來研究未知菌株與參考菌株的同源性，進而確認種。

與RAPD技術相比，UP—PCR方法的主要優點是：退火溫度更高(約55℃)，引物更長(＞16bp)，產生的條帶更復雜(最多可達100條)，重復性更好，這些都克服了RAPD技術的缺點。國際木霉與肉座菌屬分類委員會網站上對該方法有系統闡述，包括引物序列、反應體系及反應條件等。Lubeck等最先應用該方法研究木霉與粘帚菌(Gliocladiumspp，)的親緣關系，認為該方法具有區別親緣關系相近菌株的能力；并將其用于鑒定丹麥建筑物污水中分離出的44株木霉，共鑒定出6個木霉種(T.atroviride、T.citrinoviride、T.harzianum、T.kongibrachiatum、T.viride和T.hamatum)，分別屬于3個不同的進化組(section Longibrachia—turn、section Pachybasium和section Trichoder—ma)。他們認為該方法可用于區分木霉的集合種(Trichoderma viride/atroviride/koningii)，并可發展成為木霉菌株的常規鑒定方法。近年來，UP-PCR方法除用于木霉種的鑒定外，還被用于植物病原菌及其他生防菌的多樣性分析，如立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和粉紅聚孢霉(Clonos—tachys rosea)等。

3RAPD技術在木霉鑒定及多樣性分析中的應用

隨機擴增多態性DNA(random amplified poly—morphic DNA，RAPD)技術是目前在真菌多樣性分析中應用最為廣泛的一種分子生物學方法之一。其基本原理是應用隨機引物對目標基因組DNA進行PCR擴增，經電泳分離，擴增產物所呈現的不同條帶圖譜，反映了基因組相應區域的DNA多態性。在木霉的遺傳多樣性與種群多樣性分析中，RAPD技術也是應用最早，研究成果最多的一種分析手段，進而被用于木霉的分子鑒定。Dubey等應用RAPD方法分析具有生防作用的木霉，找到能夠有效區分3種生防木霉(T.viride、T.harzianum及T.virens)的RAPD引物。Singh等研究了引起蘑菇病害的18株木霉，通過結合ITS序列比對方法鑒定為T.harzianum和T.virens，并應用RAPD分析了其種間及種內多樣性。李梅云等運用RAPD技術對18個木霉菌株的基因組DNA進行多態性分析，認為RAPD遺傳標記木霉可以作為該菌分類的有效手段之一。

與其他分子標記技術相比，RAPD具有以下特點：①PCR反應靈敏度高、樣品用量少；②引物具有通用性，無需預知物種DNA序列；③操作簡便迅速，實驗成本低，無放射性污染；缺點是重復性差。近年來，RAPD技術與多種指紋圖譜分析軟件相結合，提高了對不同物種種問及種內多態性確認的準確性，在鑒定大量樣品時，在不能將所有樣品進行測序的情況下應用RAPD技術，其操作簡便且試驗成本低的特點，可以極大地提高鑒定效率。

4AFLP技術分析木霉多樣性

1995年Vos和Zabeau等建立了擴增片段長度多態性(amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)方法。它是基于PCR反應的一種選擇性擴增限制性片段的方法。用限制性內切酶酶切不同菌株的基因組DNA，產生大小不同的限制性片段，使用人工接頭將其連接，作為模板。用含有選擇性堿基的引物對模板進行擴增，選擇性堿基的種類、數目和順序決定了擴增片段的特殊性。擴增產物經放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據DNA指紋圖譜的差異來檢驗多態性。該方法廣泛應用于遺傳多樣性分析及品質鑒定等方面的研究。

Buhariwalla等首先將該技術應用于分離自印度4個花生種植地的48株木霉的多樣性分析及種質鑒定中，并結合28S rDNA序列分析技術，通過6對引物的聯合使用，共得到234個多態性條帶，鑒定出8個木霉種(T.pubescens、T.hamatum、T.koningii、T.viride、T.atroviride、T.longi—brachiatum、T.inhamatum及T.harzianum)。他們認為AFLP條帶能夠對木霉種及黃曲霉種進行鑒定，區別親緣關系相近的種，擴增子能夠用于診斷分離到的生防木霉。

該技術的主要優點是：(1)多態性豐富，很少的引物即可獲得50～100條擴增條帶；(2)受環境影響小，多為共顯性表達、無復等位效應；(3)靈敏度高，重復性好，帶形穩定；(4)無需已知DNA序列；主要缺點是：分析費用高，操作復雜；對DNA純度及內切酶質量要求高。

綜上所述，在木霉的分子鑒定與多樣性研究中，不斷有研究者將新的方法應用到該領域；并將其加以改進，不斷完善。表1總結了上述4種方法的主要特點，還有其他鑒定方法在木霉研究中應用不多，這里不再贅述。依據這些特點，人們可以根據其試驗目的及試驗條件加以選擇，從而得到準確的鑒定與分析結果。

5展望

隨著核酸測序技術的普及及各種分子標記方法的不斷完善與發展，在微生物研究領域中，對于微生物的鑒定已經從依賴于傳統的形態學及生理生化鑒定的時期逐步過渡到依靠分子生物學手段進行種質鑒定與系統發育分析的研究階段，但這并不能取代傳統的鑒定方法，而是對生理生化及形態學方法的補充。每種方法都有各自的優點與不足，都需要其他鑒定信息的互相印證才能得到準確的結果。在科技迅猛發展的今天，一些新興的分子生物學技術也將逐步應用到木霉的監測及多樣性分析之中，如實時熒光定量PCR(real time PCR)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術等。Cordier等將RAPD、SCAR及real time PCR技術相結合，用于檢測Trichodermaatroviride生防菌株在土壤中的生長繁殖情況；Yergeau等應用DGGE技術對蘆筍中鐮刀菌屬的種群多樣性進行研究，相信在不久的將來這一方法也能夠應用到木霉的多樣性分析中。

現代分子生物學技術的應用為木霉屬真菌的分類鑒定提供了一條嶄新的途徑，極大地促進了木霉分類學的發展，提高了鑒定效率，使快速準確鑒定成為可能。近年來，隨著人們對可持續發展及綠色農業要求的逐步提高，木霉作為重要的土壤生防因子必將得到進一步的研究與應用，對木霉鑒定方法的深入探討，不但能夠促進木霉的分類與生防作用的研究，也必將對其物種與多樣性、生態學與地理分布等多方面的研究產生深遠影響。