巴西橡膠樹品系對棒孢霉落葉病的抗病性鑒定

張　賀　張　欣　蒲金基　漆艷香　謝藝賢　張輝強

摘要采用巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌的分生孢子接種和其毒素接種分別測定了國內天然橡膠主產區(qū)9個主栽品系的抗病性，結果表明過濾滅菌毒素劃傷接種橡膠離體小葉片可以產生與分生孢子接種相似的癥狀，而不劃傷接種則不產生病害癥狀；121℃、20 min濕熱滅菌毒素接種無論劃傷與否均不產生病害癥狀；分生孢子和病原菌毒素兩種接種方法所測橡膠品系的抗病性之間有很好的一致性，說明毒素接種可以用來代替病原菌接種測定橡膠品系的抗病性。抗病性測定結果顯示，供試9個巴西橡膠樹品系中，PB86、熱研88-13、南華1、PR107、熱研7-33-97對病原菌表現(xiàn)出高抗，而RRIM600、南強1-97、熱研44-9則表現(xiàn)高感，GT1則表現(xiàn)中感。

關鍵詞巴西橡膠樹；多主棒孢；毒素；抗病性

中圖分類號S 432.21

棒孢霉落葉病[Corynes pora cassiicola(Berk.&Curt.)wei]是巴西橡膠樹的一種毀滅性病害，主要侵染葉片、枝條，造成橡膠樹周年反復落葉甚至幼樹死亡，嚴重降低于膠產量。巴西橡膠樹棒孢霉落葉病于1958年首次報道發(fā)生于印度，20世紀50～80年代在亞太和非洲的主要產膠地區(qū)相繼發(fā)生，并于20世紀90年代開始在這些地區(qū)膠園流行，導致大量橡膠園被迫更新，至今仍嚴重影響著該地區(qū)的天然橡膠產業(yè)。鑒于該病嚴重威脅世界天然橡膠產業(yè)健康發(fā)展，國際橡膠研究與發(fā)展委員會要求各天然橡膠生產國嚴密監(jiān)視該病的發(fā)生傳播。我國是世界天然橡膠的第六主產國和第一消費大國，天然橡膠產業(yè)是海南、云南等省的重要經濟支柱，該病的發(fā)生嚴重威脅我國天然橡膠資源安全。2007年蒲金基等首次報道在我國橡膠苗圃發(fā)生巴西橡膠樹棒孢霉落葉病。為進一步了解我國橡膠主栽品系對巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌的抗性情況，筆者采用病原菌的分生孢子接種和毒素接種法測定了國內天然橡膠主產區(qū)的9個主栽品系對該病害的抗病性。

1材料與方法

1．1供試的巴西橡膠樹品系

本試驗供試的巴西橡膠樹品系均是國內天然橡膠主產區(qū)的主栽品系，由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所提供。品系如下：南強1-97、熱研44－9、PB86、熱研88－13、GT1、南華1、熱研7－33－97、RRIM600、PR107。

1．2供試的菌種

供試菌種由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供，菌株編號為CFCC82971，該菌株單孢分離于海南省儋州市寶島新村的幼齡膠園。

1．3供試葉片的選取

取上述不同品系的老化程度一致的淡綠色葉片，取0.8％NaC10消毒5 min，清水沖洗3次，正面向上平放在墊有濕潤濾紙的保鮮盒內，100％濕度下室溫保濕備用。

1．4不同品系對病原菌分生孢子的抗病性鑒定

1．4．1病原菌分生孢子的獲得

將病原菌接種到PDA平板上，5 d之后刮取菌絲轉移到保濕的衛(wèi)生紙上，室溫下保存4 d。配制成孢子含量約為40個/視野(10倍×10倍)的懸浮液。

1．4．2不同品系對病原菌分生孢子的抗病性鑒定

每個品系選取大小一致的離體葉片6片、每個葉片正面選取3個側脈、每個側脈上劃傷接種1滴(約40μL)孢子懸浮液，室溫保濕。設置清水對照和空白對照。5 d后觀察并記錄病害嚴重度，計算平均病害嚴重度。

1．5不同品系對病原菌毒素的抗病性鑒定

1．5．1病原菌毒素的獲得

將供試菌株接種到PDA平板上，從培養(yǎng)5 d菌落邊緣打出長勢一致的菌餅(d=4 mm)接種到Cza—pek培養(yǎng)液(5個/100 mL)中，把三角錐瓶置于搖床(150 r/min)在28℃黑暗條件下培養(yǎng)21 d，即可獲得含有病原菌毒素的培養(yǎng)液。

將獲得的培養(yǎng)液用定性濾紙過濾3次，取部分濾液用細菌過濾器進行過濾除菌，獲得過濾滅菌的病原菌粗毒素；部分濾液經過121℃、20 min濕熱滅菌后獲得濕熱滅菌粗毒素。滅菌后的粗毒素置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5．2不同品系對病原菌毒素的抗病性鑒定

分別取過濾滅菌粗毒素和濕熱滅菌粗毒素接種到巴西橡膠樹的離體葉片的側脈上，分劃傷或不劃傷兩種接種法。每個品系選取大小一致的離體小葉片6片、在每個小葉片的正面選取3個側脈、每個側脈上接種1滴滅菌后的粗毒素(約40 μL)，設置清水對照和空白對照。5 d后觀察并記錄病害嚴重度，計算平均病害嚴重度。

2結果與分析

2．1病原菌分生孢子接種抗病性鑒定結果

試驗結果表明，分生孢子可通過傷口侵入，發(fā)病的病斑與自然環(huán)境中的病斑癥狀極其相似，在葉片上早期產生深褐色圓形或不規(guī)則形小病斑，病斑周圍有明顯黃色暈圈，后期病斑擴大，圓形或不規(guī)則，中央紅褐色或灰白色，紙質，有時形成穿孔，病斑外緣深褐色或紅褐色，周圍有明顯的暈圈，病斑周圍葉脈呈現(xiàn)黑色壞死，形成本病特征性的“魚骨”或“鐵軌”癥狀。并能通過組織分離獲得與供試菌株菌落形態(tài)相似、分生孢子形態(tài)、大小相似的菌株。從而證明離體葉片所接種部位發(fā)病是有病原菌侵染所致。結果還表明供試的巴西橡膠樹品系PB86、熱研88—13、南華1、PR107、熱研7-33-97對病原菌表現(xiàn)出高抗，而RRIM600、南強1-97、熱研44-9則表現(xiàn)出高感，GT1則表現(xiàn)中感(表1)。

2．2病原菌毒素接種法抗病性鑒定結果

試驗結果表明，過濾滅菌的毒素可以致使劃傷的離體葉片表現(xiàn)與病原菌活體接種相似的病害癥狀，即組織尤其葉脈呈現(xiàn)黑色壞死，產生典型的“魚骨”或“鐵軌”癥狀，但毒素不劃傷接種則不表現(xiàn)病害癥狀；121℃、20 min的濕熱滅菌后的病原菌毒素不具有活性，不能致使劃傷或不劃傷的葉片表現(xiàn)病害癥狀。用過濾滅菌毒素接種劃傷葉片法所測9個品系的抗病性(表1)與分生孢子接種法所測結果之間有很高的一致性(r=0.9599，t=8.389，t_0.01，8=3.355)。

3結論與討論

本文采用國內天然橡膠主產區(qū)的9個主栽品系對病原菌的分生孢子及其毒素進行了抗病性鑒定，結果表明過濾滅菌毒素劃傷接種橡膠離體葉片可以產生與分生孢子接種相似的癥狀，而不劃傷接種則不產生病害癥狀。說明毒素在病原菌侵入時并不起決定作用，而是在病原菌成功侵入后才發(fā)揮作用，促進病原菌的擴展。121℃、20 min濕熱滅菌毒素接種無論劃傷與否均不產生病害癥狀，這與Lamotte等報道的相一致。C.cassiicola所產毒素Cassiico—lin是一種約26ku的小分子量蛋白，濕熱滅菌后會使小分子量蛋白變性而失去活性。Cassiicolin是一種專化性毒素，是該病原菌的主要致病因子之一，國外已有學者將其用于橡膠品系抗病性鑒定。本文采用分生孢子和病原菌毒素兩種接種方法所測橡膠品系的抗病性之間有很好的一致性(r=0.959 9，t=8.389，t_0.01，8=3.355)，也說明毒素接種可以用來代替病原菌接種測定橡膠品系的抗病性。由于毒素的獲得和保存方法均較為簡便，適合于大規(guī)模橡膠品系的抗病性鑒定，這也是本試驗采取毒素接種的原因之一。

印度、馬來西亞、斯里蘭卡、喀麥隆等國家橡膠樹棒孢落葉病的發(fā)生歷史表明，病害發(fā)生早期只限于苗圃，然后在膠園個別品系或個別地區(qū)零星發(fā)生。病原菌存在明顯變異和分化，極易產生強致病力的菌株，強致病力的菌株在苗圃暴發(fā)流行，然后在膠園感病品系上大面積流行，造成嚴重的損失。如斯里蘭卡1985年首次在一苗圃發(fā)現(xiàn)該病，經過2年時間，病害就傳播擴散到該國幾乎所有膠園。目前該病在我國主要在橡膠實生苗圃發(fā)生，定植膠園發(fā)生極少，本文所選用的菌株是首次在我國幼齡膠園采集分離的一個菌株，了解我國主栽品系對該菌株的抗病性，可以為我國開展風險評估提供參考依據(jù)。抗病性鑒定結果顯示，供試的巴西橡膠樹品系中的PB86、熱研88-13、南華1、PR107、熱研7-33-97對病原菌表現(xiàn)出高抗，而RRIM600、南強1-97、熱研44-9則表現(xiàn)出高感，GT1則表現(xiàn)中感，這些感病品系在我國均有不同面積的栽培，棒孢落葉病有可能在上述感病品系上暴發(fā)流行。

面對橡膠樹棒孢落葉病對我國天然橡膠產業(yè)的潛在威脅，及時開展橡膠樹棒孢落葉病檢測技術研究、建立區(qū)域性的監(jiān)測體系；在我國橡膠主產區(qū)開展多菌株對多品系的致病性測定、優(yōu)化毒素的提取方法，運用毒素篩選優(yōu)良的抗病品系，嚴密監(jiān)控橡膠棒孢落葉病的傳播發(fā)生情況，重點監(jiān)測感病膠園的病害動態(tài)；開展病害生物學與生態(tài)學研究、評估其危險性，為決策提供依據(jù)、發(fā)展防控技術、有效提高應對病害的能力，對保障我國天然橡膠生產、供給、膠林生態(tài)安全具有重大的意義。