外源基因轉化受體系統高效再生體系的建立

隋昌海　張美萍　王　義

[摘要]以紫花苜蓿無菌苗的莖段為外植體，通過正交試驗，得到了以改良SH(SH大量元素+B5微量元素)+2,4-D1.5mg／L+KT1.0mg／L，蔗糖濃度為3％的培養基為最佳的脫分化培養基，最佳的胚狀體培養基為改良SH+KT0.5mg／L．蔗糖濃度為2％，并建立了紫花苜蓿的高效再生體系，為后續外源基因的導入奠定了良好的基礎。

[關鍵詞]紫花苜蓿胚狀體再生體系石蠟切片

隨著生命科學的發展，利用植物生物反應器即通過基因工程途徑，以常見的農作物作為“化學工廠”，通過大規模種植生產具有高經濟附加值的醫用蛋白、工農業用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其它一些次生代謝產物等生物制劑的方法，越來越受到全世界各國科學家的重視，新功能基因的分離、克隆手段逐步完善，很多功能性狀很好的基因被分離、克隆，但是目前受體系統高效再生體系不是十分理想，直接制約著生物反應器的發展。本文介紹了紫花苜蓿的高效再生體系建立的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)無菌苗的莖段，紫花苜蓿種子由吉林農業大學生物技術學院提供。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導：將飽滿的紫花苜蓿種子在滅菌蒸餾水中浸泡40分鐘后，用0.1％HgCl₂溶液消毒20分鐘，無菌水洗3-5次，接種在1／2MS培養基上，置于(23±2)℃下培養。光照強度為15001x，光照周期為12小時光照12小時黑暗。培養6天左右，待植株長至4～5厘米時取出植株，將莖段切成5毫米左右的小段接種到脫分化培養基上，進行愈傷組織的誘導，先在相同的激素條件下從MS、B5、N6、改良SH和white這5種基本培養基中篩選出最適合紫花苜蓿脫分化的基礎培養基，再以這種培養基為基礎培養基篩選出最適合的激素種類與濃度的組合，從而確定最佳的脫分化培養基，為此本試驗決定采用設計一個4因素5水平的正交試驗，并通過SPSSl2.0分析以確定最佳的激素組合和濃度，各因素及相應水平(詳見表1)。

1.2.2胚狀體的獲得：將使用上述方法培養的外植體材料培養25天左右，轉入胚狀體培養基中，同樣以正交試驗的方法來確定最佳的激素濃度與種類的組合。根據前面的試驗，設計3因素5水平的正交試驗，各因素及相應水平(詳見表2)。

1.2.3再生植株：將剝離后，接到1／2MS上進行生根培養。培養15天左右，大部胚狀體可長出不定芽及4～5條粗根。煉苗，打開瓶蓋室溫放2天，小心取出幼苗用自來水將根部的培養基洗掉，再移至花盆中(蛭石：營養土：灰土=1:1:1)培養，即可獲得再生植株。

1.2.4石蠟切片的制作

FAA固定液配方：福爾馬林5mL，冰醋酸5mL.70％酒精90mL。

蘇木精染色劑配方：0.5g蘇木色精+10m195％酒精+90ml蒸餾水+2滴H₂O₂。

取不同發育階段的愈傷組織，FAA固定1～2天→30％酒精過夜→50％酒精2小時→75％酒精2小時→85％酒精3小時→95％酒精3小時→純酒精2小時兩次→1／2純酒精+1／2二甲苯過夜→純二甲苯2小時兩次→加碎蠟(不斷加入)→45℃烘箱放置過夜(直到碎蠟達飽和為止)→60℃烘箱放置4小時→過純蠟3小時兩次→包埋→修蠟塊→切片機切片→梅氏蛋白粘片→烘干備用。

制作好的切片自然干燥數天后就可進行脫蠟、染色。步驟如下：二甲苯脫蠟10分鐘兩次→1／2二甲苯+1／2酒精10分鐘→純酒精10分鐘兩次→95％酒精5分鐘→85％酒精5分鐘→70％酒精5分鐘→50％酒精5分鐘→30％酒精5分鐘→蒸餾水1分鐘→4％鐵礬溶液1小時→蒸餾水5分鐘→0.5％蘇木精染色30～40分鐘→餾水沖洗→4％鐵礬溶液浸泡2分鐘→50％酒精5分鐘→70％酒精5分鐘→85％酒精5分鐘→95％酒精5分鐘→純酒精10分鐘兩次→二甲苯10分鐘兩次→中性樹膠封片→烘箱烘干(溫度不可過高)→石蠟切片照相觀察。

2結果與分析

2.1最佳培養基的確定

由表3可知，最適合紫花苜蓿脫分化的基礎培養基為改良的SH培養基，即SH無機物+MS有機物。

2.2脫分化培養基中激素濃度與種類的最佳組合：本試驗以紫花苜蓿無菌苗的新生莖段為外植體，根據正交設計表在同一基礎培養基上添加相應的激素，結果發現脫分化發生的時間和發生率均有所不同，試驗結果經SPSS12.0統計軟件的LSD分析，以愈傷組織的誘導率為考察指標表明，改良SH+2,4-D1.5Smg／L+KT1.0mg／L，蔗糖濃度為3％的培養基應該為最佳的脫分化培養基。為驗證試驗的準確性隨機選擇正交試驗中的3組培養基與最佳培養基進行比較實驗，(詳見表4)中的數據表明改良SH+2,4-D1.5mg／L+KT1.0mg／L蔗糖濃度為3％的培養基確為最佳的脫分化培養基。

試驗發現在不添加2,4-D，蔗糖濃度為2％時，愈傷組織生長狀態較好，有時還能分化出同時具有根和芽的小植株。

試驗結果經SPSS12.0統計軟件的LSD分析表明，以胚狀體的形成為考察指標，2,4-D的影響達到顯著水平(P＜0.05)，KT、蔗糖的影響未達到顯著水平(P＞0.05)，且蔗糖作用大于KT作用，即3種影響因素對胚狀體形成的影響程度依次為2,4-D＞蔗糖＞KT，表明2A-D和蔗糖是影響紫花苜蓿胚狀體形成的重要影響因子。故而可知最佳的胚狀體培養基應為：改良SH+KT0.5mg／L，蔗糖濃度為2％。

3小結

3.1培養基的影響：在試驗中發現改良SH培養基最適宜于紫花苜蓿脫分化，其它培養基雖然也可以使紫花苜蓿脫分化，但是脫分化的時間和比率均遠不如改良SH，可見不同的養分組成的培養基對紫花苜蓿脫分化的誘導影響很大。

3.2激素的影響：在紫花苜蓿組織培養中常使用的生長素有2,4-D、NAA、IAA、IBA等，通常認為2,4-D是體細胞胚再生的關鍵激素；常用的細胞分裂素主要有KT、BA，其作用是促進細胞分裂，促進芽的分化等。本試驗也充分證實了這一觀點。

3.3胚性愈傷組織的細胞學觀察

3.4體細胞胚發生各個階段的細胞學觀察

通過試驗確定了外源基因轉化受體系統高效再生體系建立的相關數據，建立了以紫花苜蓿為材料的外源基因轉化受體系統高效再生體系。培養出了大量的胚狀體，為后續外源基因的導人奠定了良好的基礎，為植物生物反應器的發展提供條件。附圖為紫花苜蓿外源基因轉化受體系統高效再生體系建立的全過程。