轉基因植物重組ＤＮＡ和表達蛋白的環境分子行為

陳　洋　張永軍　吳孔明　彭于發　郭予元

摘要：轉基因植物的安全性已經在全球范圍內引起了普遍關注。本文從分子水平上就轉基因植物的重組DNA在環境中的降解動態、轉基因植物重組DNA在生物體內的傳遞、轉基因植物殺蟲蛋白在環境中的降解及在食物鏈間的傳遞等有關研究進展作一簡要介紹。

關鍵詞：轉基因植物；重組DNA和蛋白；降解和傳遞；食物鏈

中圖分類號：Q 78

1引言

轉基因作物自1996年在美國商業化種植，已經歷了10年的發展，到2006年，全球轉基因作物播種面積超過1億hm²，美國、阿根廷、巴西、加拿大、中國：等國轉基因作物的總種植面積超過8 900萬hm²。目前已獲得的轉基因植物主要有棉花、大豆、玉米、煙草、番茄、馬鈴薯等。與此同時，轉基因植物的安全性已經在全球范圍內引起了普遍關注，尤其是轉基因植物重組DNA和表達蛋白的環境分子行為成為國際研究熱點之一。轉基因植物的重組DNA可以作為自由的DNA在環境中活動通過植物的根部和花粉進行擴散，在土壤中殘留而對一些微生物造成影響，還可以經過水平和垂直傳播，滲透到農田周圍的地下水和其他水體中，而對一些細菌等微生物具有潛在影響。重組蛋白在轉基因植株的整個生育期都有表達，使取食而存活下來的靶標及非靶標昆蟲體內的組織器官會不同程度的含有轉基因蛋白，當天敵取食這些靶標和非靶標昆蟲時，這些重組蛋白就有可能傳遞到其天敵的體內，直接或間接通過食物鏈(網)對天敵的數量和質量產生影響。重組蛋白還可以通過根系的分泌或者植株殘體的降解進入土壤中，有可能對土壤生物系統產生影響。

2轉基因植物重組DNA的降解動態

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增，在擴增反應結束之后，通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析。Widmer等人最先用PCR手段對田間土壤中殘留的植物基因組DNA進行了定量分析。隨后，Alvarez等采用PcR技術對與黏土礦物結合的DNA進行了擴增。Lutz等利用PCR技術把非重組基因rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因)與重組crylAb基因在轉基因玉米青貯時期的降解進行了比較。根據兩種基因的全長，對rubisco基因設計了5對引物，相對應的片斷大小分別為：173、896、1 197、1 753和2 521 bp；對crylAb基因設計了4對引物，相對應的片斷大小分別為：211、420、727 bp和1 423 bp。rubisco基因的173 bp片斷在玉米殘體內61 d后仍然可以檢測到，到第30天為止，還可以檢測到1 197 bp的片斷，但是2 521 bp的片段只有在第1天出現。另外，直到第61天還可以檢測到211和420 bp的crylAb基因片段，727 bp片斷在第30天內可以檢測到，而1 423 bp的片段在前6天可內檢測到。因此認為crylAb基因的降解過程與非重組基因rubisco的降解過程是相似的。

無論定性還是定量分析，分析的都是PCR的終產物。但是在許多情況下，所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。實時定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在DNA量比較少的情況下，可以應用實時定量PCR方法對重組DNA進行檢測。一些轉基因植物具有抗生素基因作為選擇標記，這些抗生素基因盡管經過生命體和非生命體的降解，例如：微生物的、物理的、化學的降解，但是這些細胞外DNA仍可以作為自由的DNA在環境中活動，并且可能被一些水中的細菌所利用，使得它們獲得抗性，因此可能對環境和人類健康存在潛在的危害。Zhu用一種高靈敏度的sYBR Green Ⅰ作為熒光染料的實時定量PCR方法對轉Bt基因玉米(MON863)中的nptⅡ(新霉素磷酸基轉移酶Ⅱ基因)進行了定量分析，并且監測了兩種地下水和河流水中npt Ⅱ基因降解的動態。實時定量PCR試驗表明，兩種地下水和河流水中的DNA擴增模式相似；3種水質高壓滅菌處理后的Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)沒有改變，表明了高壓滅菌處理中的DNA的穩定性。在3種水質的未被處理和過濾除菌處理中，在48～96 h內DNA的含量從0。8 mg／mL降到0.008 mg／mL，與此相反，高壓滅菌的水中DNA的含量沒有改變。因此認為不同的水質和環境條件可能是影響DNA降解速度的因素，而較低的溫度是影響微生物和酶的活性進而導致DNA降解減慢的原因之一。Douville等人也利用實時定量PCR技術對轉基因玉米地周圍的不同環境中crylAb基因的存在和殘留進行了研究，發現crylAb基因在表面水和沉淀物中分別可以保持21 d和40 d，即使是過濾除菌的表面水中的crylAb基因的半衰期也沒有明顯增長。在黏沙土沉淀物中40 d以后可以檢測到來源于Bt玉米的crylAb基因，在距離玉米地下游的82 km處的水中仍然可以檢測到crylAb基因。Gebhard等選取了3對特異性引物來擴增轉基因重組DNA，在田間情況下，幾個月后也可以檢測到轉基因甜菜DNA組中的769bp npt Ⅱ基因。

3轉基因植物的重組DNA在生物體內的傳遞和降解

有些學者認為轉基因煙草完整的重組DNA經過自然轉化有可能進入細菌的基因組中。Rossi等人研究了來源于轉基因玉米飼料中的crylAb基因在小雞消化道中的降解。Zein基因是具有高拷貝數的玉米基因，作為玉米的內標準基因。crylAb基因是插入到玉米系MON 810中的修飾后的單拷貝Bt抗蟲基因。作者選取了1 800 bp的片段長度作為一個最小化的功能單位，能夠編碼整個Bt毒素蛋白。通過監測crylAb轉基因可以來檢測轉基因玉米的重組DNA。另外，Sh-2基因是雞卵黃原蛋白基因，也是玉米的一種單拷貝基因，與crylAb大小相似，可以作為對照。作者比較了轉基因植物的DNA降解是否表現出與非轉基因植物的DNA降解不同。研究發現，可以在雞所有的胃腸部分監測到Zein基因片斷，并且在取食轉基因和非轉基因玉米飼料的雞中檢測到的Zein基因沒有差異。在空腸、盲腸和血液中都不能擴增到1 800 bp的crylAb基因和Sh-2基因，并且超過500 bp的DNA片斷未在腸的末端區域檢出。轉基因和非轉基因植物處理中的DNA檢出頻率沒有顯著區別，這表明基因修飾沒有對DNA降解過程產生顯著影響。因此，Rossi認為來源于轉基因植物飼料中的DNA與來源于常規植物飼料中的DNA最終在環境中的歸宿是一樣的。

4轉基因植物殺蟲蛋白在環境中的降解

轉基因植物的根系分泌物中有可能含有重組蛋白，同時收獲后的轉基因植物的殘體進入到土壤生態系統，可能對土壤微生物系統造成影響。已有研究表明，在轉基因玉米、水稻和馬鈴薯的根系分泌物中檢測到cry基因編碼的殺蟲蛋白，但是轉基因棉花和煙草的根系分泌物中未檢測到殺蟲蛋白。Hopkins等研究表明，在實驗室條件下，向土壤中加入的轉Bt基因玉米和非轉基因玉米殘渣的分解沒有明顯的差別，并且已分解的植物組織和土壤混合物中的Bt殺蟲蛋白在實驗室孵育的過程中迅速降解，在14 d以后低于檢測極限。Baumgarte等在田間對轉基因玉米(MON810)根系物及土壤進行抽樣，采用ELISA方法測定了其中crylAb蛋白的含量。在土壤中的CrylAb蛋白含量要比根系物中的含量(1 g土壤中的含量為0.1～10 ng)要低，并且在收獲后的土壤中翌年4月份后仍然可以檢出CrylAb蛋白，含量是0.21 ng／g，而此時葉片殘體中的蛋白含量高達21 ng／g，根殘體的含量更高一些達到183 ng／g，根殘體中的蛋白含量僅為完整根部的12％。隨后過2個月以后抽樣發現，蛋白進一步迅速降解。

Zwahlen等同樣用ELISA方法研究了瑞士種植區的兩塊田地的轉Bt基因玉米葉片的crylab毒蛋白在秋季、冬季和次年春季的降解情況。第1個處理中植物材料切割成大片裝進有大網眼的垃圾袋中然后埋在土壤中，模仿耕作系統中的土壤內玉米殘渣。在第1個月里沒有發現crylAb毒蛋白降解。在第2個月中，crylAb毒蛋白的濃度卜降到原始濃度的20％，在冬季沒有進一步的降解。次年春天氣溫上升后，毒蛋白繼續緩慢降解，直到次年6月仍然可以檢測到毒蛋白。第2個處理模擬在免耕系統中的降解，把植物材料直接放在土壤的表面，crylAb毒蛋白濃度在40 d內降低到初始濃度的38％。毒蛋白在試驗結束的200 d后持續降解。直到翌年6月份，CrylAb毒蛋白的量只有最初的0.3％。Lutz等人采用ELISA方法研究了青貯玉米飼料中的crylAb蛋白降解動態，研究發現，在43 h之內crylAb蛋白沒有顯著的降解，在此后的20 d和60 dCrylAb蛋白有顯著的降低。同時用免疫印跡方法研究發現，在儲存期的前兩天內60 kD大小的有活性的CrylAb蛋白存在，且信號很強，在第8天仍然可以檢測到微弱陽性信號，但是在12 d以后沒有發現有活性的CrylAb蛋白。

Abmad對土壤和蚯蚓的腸道和排泄物中的cry3Abl蛋白進行了檢測，在罐子中的土壤和接觸Bt玉米根部的蚯蚓的腸道和排泄物都檢測到了Cry3Abl蛋白，在12 d和33 d上述蛋白含量沒有顯著差異。而另一項研究發現在美國Manhat～tan(曼哈頓島)附近，連續種植轉基因玉米最初的1年和以后的3年里，利用ELISA方法檢測不到任何一個從Bt玉米混合田及非Bt玉米田土壤樣本中的cry3Abl蛋白。但是，在美國的scandia(斯堪的亞)附近種植轉基因玉米的第1年的土壤中檢測到少量的Cry3Abl蛋白，含量為干重3.38～6.89 ng／g。這些發現表明從根部分泌的或者腐爛的植株殘體的cry3Ab1很快就會在土壤中降解，殘留時間很短。

5轉基因植物殺蟲蛋白食物鏈間的傳遞

重組蛋白在植物的整個生育期得到持續表達，在對靶標昆蟲起到良好控制作用的同時，也對一些非靶標害蟲產生了影響。對取食轉基因玉米的禾薊馬(Frankliniella tenuicornis Uzel)不同時期體內的crylAb毒素進行定量分析，并對毒素在成蟲體內的殘留時間進行研究，數據表明在禾薊馬的幼蟲和成蟲體內Bt毒素的含量最高，在不進食的預蛹期和蛹期沒有檢測到Bt毒素的存在。在成蟲體內Bt毒素的殘留時間很短，在24 h之內，CrylAb毒素含量減少了97％量，8 d之后檢測不到Bt毒素的存在。Howald等人研究了轉基因油菜對非靶標食草蟲黃翅菜葉蜂[Athalia rosae(Linnaeus)]的影響。測定了Bt油菜葉片、取食Bt油菜的黃翅菜葉蜂的排泄物、各齡期幼蟲、蛹和成蟲中CrylAc蛋白的含量。在幼蟲體內和糞便內檢測到的CrylAc蛋白的含量要比在葉片中的含量少。在幼蟲、蛹和成蟲體內都檢測不到crylAc蛋白。因此認為crylAc蛋白不會對黃翅菜葉蜂本身產生影響，由于在它消化和排泄后依然可以檢測到蛋白的存在，因此有可能對其他生物體間接造成影響。weber等人的研究也表明，盡管馬陸排泄掉了大多數的Bt蛋白，Bt蛋白不會對它造成影響，但是它的排泄物中的Bt蛋白仍然有活性，這就有可能對其他的土壤生物造成影響。

靶標或非靶標害蟲的體內都會不同程度地含有重組蛋白，直接或間接地對捕食性天敵和寄生性天敵產生影響[。已有很多報道轉基因作物對捕食者幼蟲的發育歷期及死亡率，蛹重及成蟲存活時期的影響。Duttin等人也對轉基因玉米上的3種草食性昆蟲體內的毒蛋白進行了測定。在二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)中檢測到CrylAb毒素的含量最高，為2.5 μg／g，其次是棉貪夜蛾[Spodo ptera littoralis(Boisduval)]，為0.72 μg／g，在禾谷縊管蚜[Rhopalosi phum padi(Linnaeus)]中只能檢測到很痕量的毒素。當給普通草蛉[Chryso perla carnea(Stephen)]飼以上述3種草食性昆蟲后，取食二斑葉螨和禾谷縊管蚜的普通草蛉的死亡率、發育歷期和體重沒有受到影響。相反，當給普通草蛉喂了棉貪夜蛾后，表現出了明顯的死亡率上升和發育延遲。二斑葉螨和棉貪夜蛾雖然體內都含有Bt毒素，但是對普通草蛉的影響卻不相同，可能是因為普通草蛉對棉貪夜蛾的捕食量少和Bt毒素的交互作用共同導致了普通草蛉取食了棉貪夜蛾后所產生的消極效應。

Torres等人對轉基因棉花一害蟲一捕食者3級食物鏈進行了研究，選取了4種草食性昆蟲、7種捕食性天敵，在甜菜夜蛾幼蟲體內檢測到的crylAc蛋白只有14％傳遞到了捕食性斑腹刺益蝽[Podisusmaculiventris(say)]體內，這就表明crylAc蛋白可以在3級營養階層間傳遞。

為了驗證捕食者是否直接受Bt毒素的影響，Jorge等人檢測了田間代表3個營養級的材料，即：轉基因棉花DPL 458RR(轉crylAc基因棉花)，取食轉基因棉花的甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hnbner)]，及其雜食捕食性天敵大眼長蝽[Geoco-ris punctipes(Say)]中crylAb蛋白的含量。取食轉基因棉花葉片的甜菜夜蛾幼蟲體內含有Bt毒素，這樣Bt毒素通過甜菜夜蛾幼蟲，使大眼長蝽幼蟲和成蟲分別有機會接觸到葉片中原始含量的81％和76％的毒蛋白，但是在大眼長蝽成蟲體內沒有檢測到CrylAc蛋白。也有研究表明在一些捕食性天敵的體內可以檢測到CrylAc毒蛋白的存在。

couty等人報道GNA可以通過營養階層傳遞，GNA對寄生蜂[Aphidius ervi(Haliday)]的影響是和GNA的濃度有關。寄生蜂的幼蟲可以排泄出大部分已經消化的GNA，但是可以在蛹中檢測到一小部分的GNA。

室內對轉基因水稻KMD1中的CrylAb毒蛋白經食物鏈在幾種主要害蟲及其捕食性天敵體內的積累進行了研究，表明二化螟[Chilo suppressalis(walker)]和稻眼蝶(Mycalesis gotama Moore)幼蟲體內的crylAb蛋白含量均隨取食時間延長逐漸下降，二化螟和稻眼蝶幼蟲的糞便中均檢測到較高濃度的CrylAb蛋白，二化螟幼蟲血淋巴中檢測到CrylAb蛋白。褐飛虱(Nila parvata lugens Stal)、麥長管蚜(Macrosiphum miscanthi)以及飼喂取食過KMDl的二化螟或稻眼蝶幼蟲的擬水狼蛛[Pi-rata subparaticus(Boes.et Str.)]體內都含有一定濃度的CrylAb，這就表明crylAb蛋白可以沿著水稻－害蟲－天敵食物鏈傳遞。

轉基因植物的花粉或花蜜中也不同程度的含有重組蛋白，這就有可能對一些傳粉昆蟲或重要的經濟昆蟲造成影響。因為ELISA方法存在檢測下限，所以認為在飼喂轉基因玉米花粉的蜜蜂成蟲的下咽腺中未檢測到CrylAb蛋白，轉crylAb基因玉米花粉飼喂異色瓢蟲[Harmonia axyridis(Pal-las)]后，在瓢蟲體內也未檢測到Bt殺蟲蛋白，轉crylA6玉米花粉對異色瓢蟲生長發育沒有顯著負面影響，初步證明Bt玉米MON810花粉對異色瓢蟲是安全的。也有研究報道取食轉crylAc基因棉花花粉的意大利蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)6日齡幼蟲體內能夠檢測到Bt殺蟲蛋白。