用無性系變異獲得抗條銹小麥新品系４－８研究

楊隨莊　葉春雷　曹世勤

摘要：以永良4號春小麥幼胚為外植體進行組織培養，將獲得的愈傷組織經過繼代培養、分化培養后獲得45株移栽成活的再生植株，通過田問條銹病誘發鑒定選擇，獲得了抗條銹病小麥種質資源材料4-8。研究結果表明，4-8在田間連續5個世代中均表現對當前流行的條銹菌混合菌系(條中31號、條中32號、水-4、水-5、水-7、水-14)免疫；人工接種鑒定中，在苗期對上述混合菌系表現免疫，成株期分小種和混合菌系鑒定中仍表現免疫，說明通過組織培養獲得的小麥種質材料4-8具有穩定遺傳的條銹病抗性變異，從而為利用體細胞無性系變異進行小麥抗條銹病新種質創制提供了可能。

關鍵詞：小麥條銹病；小麥體細胞無性系；抗條銹病新種質

中圖分類號：S 435．121

小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)引起的一種世界性重要病害，在我國也：黽發生范圍最廣、危害最重的小麥病害之一，是限制小麥生產的重要生物因素之一，曾多次大流行并造成巨大損失。化學防治雖能降低條銹病的危害，但從資源節約、環境友好、綠色發展的：角度來看，選育和推廣種植抗病品種才是最為經濟、安全和有效的控制途徑。因此，抗銹育種是一項長期而重要的工作。選育新品種的根本在于種質資源的發掘、創造、研究和利用，已通過常規育種、染色體工程、外源DNA導入等方法獲得了小麥抗銹種質資源和品種，為促進小麥生產作出了重要貢獻。本文通過組織培養方法獲得了抗條銹病小麥種質資源，為利用體細胞無性系變異進行小麥抗條銹病育種提供參考。目前未見類似報道。

1材料與方法

1．1組織培養獲得無性系植株

將永良4號小麥授粉(自花授粉)后14 d的幼胚接種在MS+2，4-D 2 mg／L+KT 0.5 mg／L+AgNO₃8 mg／L+CH 300 mg／L+蔗糖3％+瓊脂粉0.5％培養基上，在25℃條件下暗培養30 d獲得愈傷組織，挑選新鮮的愈傷組織接種在MS+2，4-D 1～2 mg／L+KT 0.5 mg／L+CH 300 mg／L+ABA 0.5 mg／L+蔗糖6％+谷氨酰胺0.5 g／L+瓊脂粉0.5％繼代培養基上進行繼代培養，每25～30天繼代培養1次，培養6個月后(培養溫度為25℃，自然散射光照)，將繼代培養的愈傷組織轉接到分化培養基(MS+KT 1.0 mg／L+IAA 0.5 mg／L+CH 300 mg／L+蔗糖3％)上，在25℃、2 000～3 000 1x、16 h(光)∥8 h(暗)條件下進行分化培養獲得再生植株(R₁代植株)，練苗后移栽到溫室中，同時種植供體親本永良4號為對照，常規管理，抽穗后套袋自交，成熟后按單株收獲種子。

1．2無性系株系抗條銹病田間誘發鑒定

田間試驗于2002－2006年在甘肅農科院蘭州試驗農場進行。按行長1.80 m、行距0.20 m、株距0.04 m點播種植(南北方向)，每行點播46粒，R₂代材料種子全部播種，R₃代及其以后各世代材料播種2行，每10份無性系材料設一原供體親本永良4號為對照(種2行)。在試驗小區的垂直方向(東西方向)兩邊種植銘賢169作為誘發行，每年4月底～5月初用心葉涂抹法在銘賢169上接種當前流行混合條銹菌系，于6月20日左右觀察記載條銹病發病情況。對獲得的抗銹新品系再送本院植保所進行專門鑒定。田問觀察記載和考種項目按常規育種要求進行，系譜法選擇，各種材料按種植小區和株系收獲。

1．3無性系品系抗條銹病人工接種鑒定

抗條銹病人工接種鑒定試驗于2006年在甘肅省農業科學院植保所蘭州溫室和甘谷試驗站進行。種植及接種方法進行，每處理重復3次。

1．4條銹病記載標準

條銹病的記載采用全國統一的0、0；1、2、3、4六級記載標準，0～2表示抗病，3～4表示感病。

1．5供試條銹菌種

誘發鑒定中將條中31號、條中32號、水-4、水-5、水-7、水-14菌系等量混合后接種銘賢169；將上述菌系等量混合，在苗期人工接種供試材料；在成株期，分別將各菌系和等量混合菌系接種供試材料。所有菌系均由本院植保所提供。

2結果與分析

2．1組織培養及再生植株表現

2000年接種永良4號幼胚500個，獲得愈傷組織491塊，愈傷組織誘導率為98.2％，繼代培養后進行再分化培養獲得再生植株55株，植株再生率為11.2％。55株再生植株移栽到溫室中，成活45株。這些再生當代植株(R₁代)總體表現為：株高顯著降低，約為對照的30％～70％，葉片變窄變短，株型小而緊湊，穗長變小，小穗數減少，抽穗期和成熟期顯著提前或推遲，有的R₁植株移栽成活30 d后即抽穗，有的植株比對照晚熟20 d以上。所表現的這些變異除包含有可遺傳變異外，也有組織培養的生理效應。

2．2無性系株系抗條銹病誘發鑒定

2002年將45個再生株系(R₂)全部種植在田間，其中代號為4-8、4-21、4-27的株系中出現抗病植株和感病植株兩種類型，4-8株系中出現了19株一致的抗條銹病變異類型(反應型為0型)，而另外2個株系中出現了分離的抗病變異類型(4-21株系中出現3株抗銹單株，4-27株系中出現4株抗銹單株，各單株的條銹病反應型為1～2型，原供體親本永良4號的反應型為4型)。將R₂代中抗病的32個單株全部收獲，考種，在R₃代中種植為32個株系，這32個株系間條銹病抗性發生分離，其中19個株系表現一致抗條銹病(反應型為0型，對照品種永良4號為4型)，占觀察株系數的59.4％，1個株系抗病性表現分離(其中出現3個抗病單株，反應型為2型，其余為3～4型)，占觀察株系數的3.1％，其余12個株系表現不抗條銹病(反應型為4型)，占觀察株系數的37.5％。說明R₂代中出現的大部分抗條銹病性狀能夠遺傳到R₃代，37.5％的株系在R₂代中出現的抗病變異性狀不能傳遞到R₃代，或者是由于突變獲復而表現為親本的抗性水平。

根據R₃代抗銹材料的田問農藝性狀表現和考種結果，從中入選253個單株種植成R₄株系進行鑒定觀察，其中來源于R₃代中19個株系表現一致抗銹的250個單株株系間抗病性一致(反應型為0型，對照品種永良4號為3型)，說明這些株系的抗病變異性狀已穩定，并能傳遞，而另外3個株系表現為不

抗條銹病(反應型為3～4)，說明這些抗病變異性狀不能遺傳或發生了突變獲復。根據田間觀察和考種評價，這些材料的農藝性狀基本穩定，株系內整齊一致，各株系間在株高、株形、穗長、抗銹性方面相似，在有效分蘗、穗粒數、德粒重方面差異明顯，與原供體親本之間差異明顯。從R₄代中入選45個抗條銹病株系(均來源于R₂代的4-8株系)進入R₅代進行抗銹性鑒定和農藝性狀觀察，在R₅和R₆代中，這45個株系的抗銹性和農藝性狀在株系內表現穩定一致，株系間及與原供體親本對照問差異明顯，并保持了R₄代中的特性，說明抗銹性及其他農藝性狀變異在R₃代已穩定，并能遺傳到以后的3個世代。

根據無性系材料歷代田間表現和考種分析結果，從中決選一個株系，定名為4-8，其生物學特性見表1(R₆代結果)。與原供體親本永良4號相比較，4-8對條銹病免疫，落黃熟相好，葉片變小，上舉，葉功能期延長，株高降低，生育期提前，有效分蘗和結實小穗數增加，穗長、穗粒數和千粒重變小。

2．3無性系株系抗條銹病人工接種鑒定

2006年將4-8及其原供體親本永良4號一并送本院植保所進行條銹病抗性人工接種鑒定，鑒定結果表明(表2)，4-8在苗期和成株期對目前流行小種混合菌免疫，成株期對各生理小種也表現免疫，這一結果和田間誘發鑒定的結果相同，進一步說明了獲得的抗條銹病變異性狀遺傳到R₆代中，4-8具有良好的條銹病抗性。

3討論

體細胞無性系變異是植物組織培養過程中的一種普遍現象，已從組織培養再生植株的形態、生理生化、分子水平上得到驗證。有關體細胞無性系抗病性的變異已在小麥、大麥、水稻、珍珠粟、亞麻等作物中得到證實。用體細胞無性系變異方法進行作物抗病性改良一般有兩種方法，一是在組織培養的培養基中加入病原物(或病原物毒素)作為篩選劑進行脅迫選擇而獲得抗病突變體，二是利用組織培養過程中的自然變異，通過抗病性鑒定而獲得抗病無性系種質。本項研究中的4-8小麥品系就是通過后一種方法獲得再生植株，在田間誘發鑒定中選擇得到的無性系后代材料，通過連續5個世代田間誘發鑒定選擇及人工接種鑒定，對當前流行的條中31號、條中32號、水-4、水-5、水-7、水-14條銹病菌系表現免疫，證明其抗銹性能穩定遺傳，這是利用體細胞無性系變異的前提條件。說明了利用體細胞無性系變異創造抗條銹小麥種質資源的可行性，而且該方法簡便、時間短，同時也可進行其他農藝性狀改良。目前未見有關小麥體細胞無性系抗條銹病的報道。

由于植物體細胞無性系變異的隨機性，既有正向變異，又有負向變異，而且往往有幾個性狀同時發生變異，在一個無性系材料中同時出現目標性狀的變異頻率低，因此，從育種的觀點出發，為了達到目標性狀綜合改良的目的，就要保證足夠多的再生植株，這樣才有可能得到理想的突變體。目前，就小麥組織培養再生體系來說，總的情況是組織培養植株再生率比較低，因此研究和優化小麥組織培養再生體系，提高組織培養植株再生率是小麥體細胞無性系變異育種的一項重要工作。本研究中只獲得了45個再生植株，從中決選出1個品系，雖然該品系在株高、生育期、株型、抗銹性、有效分蘗方面優于原供體親本，但穗長、穗粒數和千粒重方面出現了不利變異，其生產利用價值有待進一步鑒定。

體細胞無性系中，上一代中表現出的變異在下一代不表現，出現這種現象的原因一方面是由組織培養的生理效應引起，另一方面與突變的恢復有關。在其他作物體細胞無性系變異中也有類似的報道。本研究中，R₂代中獲得32個抗銹單株，最終只有19個單株的抗銹變異性狀遺傳到R₆代，這種現象在研究其他農藝性狀時也出現，是體細胞無性系變異中的一個普遍現象。

變異性狀穩定速度快是體細胞無性系變異的…·個特點。本文研究中，4-8的抗條銹病變異在R₃代中已穩定，并能傳遞到以后的3個世代，進一步證實了前人的研究結果。

有關4-8品系的抗銹性遺傳學研究目前著手開始組配雜交組合(正反交)，擬對其抗條銹性遺傳基礎進行研究。