生防枯草芽孢桿菌Ｌ１特性的初步研究

李永剛　宋興舜　趙雪瑩　馬鳳鳴

摘要：通過對峙培養(yǎng)，測定出枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜較寬，特別是對水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果明顯；枯草芽孢桿菌L1不同發(fā)酵時間經(jīng)濕熱滅菌處理后，5 d發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)含量最高，對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制率達83.23％，發(fā)酵液隨時間延長抑菌效果不再增加；枯草芽孢桿菌L1新疆棉花立枯病根際拮抗放線菌的篩選1抑菌活性物質(zhì)對溫度不敏感；枯草芽孢桿菌L1發(fā)酵液用硫酸銨梯度沉淀法提取粗蛋白在硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)抑菌效果最好，對水稻紋枯病菌平均抑菌半徑達1.15；枯草芽孢桿菌L1對玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻無致病性，而且還有保鮮和促生作用。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；抑菌物質(zhì)；粗蛋白；致病性

中圖分類號：S 482．292

水稻紋枯病(rice sheath blight)是水稻上三大重要病害之一，從全國范圍看，部分省、地區(qū)稻紋枯病超過稻瘟病的危害，居水稻三大病害之首。由于當前推廣的水稻品種缺乏高抗紋枯病基因，隨著矮稈品種和雜交水稻的大面積推廣及水田管理等措施的影響，水稻紋枯病發(fā)生面積正逐年擴大，導(dǎo)致我國水稻產(chǎn)量年損失在10％以上。長期以來，我國大多數(shù)稻區(qū)都使用井岡霉素防治，雖然井岡霉素能夠有效地控制水稻紋枯病，但是大面積、長期使用井岡霉素，極易導(dǎo)致病原菌Rhizoctonia solani產(chǎn)生抗藥性，這個問題已引起國內(nèi)外有關(guān)專家的高度關(guān)注。戊菌隆等防治紋枯病的化學(xué)農(nóng)藥又產(chǎn)生毒性及殘留問題，且污染環(huán)境。所以，探索新的防治途徑十分必要。

在研究開發(fā)的各種生防菌中，利用生防細菌來防治植物病害成為國內(nèi)外在生物防治研究中的一個熱點。大量的研究表明，生防細菌不僅在其生長發(fā)育過程中產(chǎn)生多種拮抗性或競爭性的代謝產(chǎn)物，通過直接或間接作用，達到阻礙或殺死病原菌的效果，而且這些細菌多是從植物的根圍和葉圍等處分離得到的，對植物具有較好的親和性，接種后易于在植物上定殖，生防效果持久穩(wěn)定。

芽孢桿菌(Bacillus spp.)是一類受到廣泛重視的拮抗細菌，其顯著特點是芽孢對干燥、熱、紫外線及有機溶劑的抗性。美國迄今已有4株枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生防菌株獲得環(huán)保局(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，它們是GB03、MBI600、QST713和B.subtilis var.amyloliqudefa-ciens FZB24；在國內(nèi)，1998年陳志誼應(yīng)用Bacillussubtilis B916防治水稻紋枯病面積達2 000 hm²，防治效果達50.0％～81.9％，說明用Bacillus來開發(fā)生防制劑的巨大優(yōu)勢。

本課題組從水稻根際中篩選到1株對水稻紋枯病菌具有很好拮抗效果的枯草芽孢桿菌L1，圍繞該菌的特性，進行了相關(guān)研究。

1材料與方法

1．1枯草芽孢桿菌L1抑菌譜的測定

1．1．1供試生防菌株

枯草芽孢桿菌L1由本課題組自水稻根際土中分離、鑒定并保存。

1．1．2供試病原菌

供試菌株為桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、水稻紋枯病菌[Rhizoctonia solani(rice)]、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、大豆菌核病菌(Sclerotinia scle-rotiorum)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、辣椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，由本實驗室自行分離并保存，其中水稻紋枯病菌為指示菌株。

1．1．3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)細菌采用NA(牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH7.0)，液體培養(yǎng)采用KB(蛋白胨20.0 g、K₂HPO₄·3H₂O2.5 g、MgSO₄·7H₂O15.0 g、甘油10 mL、水1 000 mL、pH7.0)，拮抗作用測定用PDA(馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL)。

1．1．4試驗方法

對供試的9種植物病原菌進行拮抗作用的測定，枯草芽孢桿菌L1在NA培養(yǎng)基上28℃活化48 h后畫線接種在距PDA平板中心3 cm處，然后在此PDA平板的中央接種經(jīng)過擴繁的水稻紋枯病菌菌碟(d=0.7 cm)，每個處理3次重復(fù)，放入恒溫箱中26℃培養(yǎng)96 h后測量植物病原菌菌絲生長的最長半徑與最短半徑，計算其比值。

1．2不同時間處理發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌絲生長的影響

生防細菌在定量100 mL KB液體培養(yǎng)基中28℃170 r／min振蕩培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、10 d后，濕熱滅菌后取濾液加入定量的PDA培養(yǎng)基中使用濃度達到2％，充分混勻，倒入15 mL于滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻后在平板中央接種0.7 cm的水稻紋枯病菌菌碟，以無菌水處理為空白對照，每個處理3次重復(fù)，26℃培養(yǎng)48 h后測定水稻紋枯病菌菌落直徑，計算抑菌率。

1．3不同溫度處理發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌絲生長的影響

將枯草芽孢桿菌L1在定量100mL KB液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL／300 mL三角瓶)28℃170 r／min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h的菌液經(jīng)細菌濾器過濾后，經(jīng)過20℃、-20℃處理24 h，121℃處理20 min后，采用菌絲生長速率法按3％的濃度測定其抑菌率，方法同1.2，加無菌水處理為空白對照，每個處理3次重復(fù)，26℃培養(yǎng)48 h后測定水稻紋枯病菌菌落直徑，計算抑菌率。

1．4抗菌粗蛋白質(zhì)的提取及活性測定

1．4．1抗菌粗蛋白質(zhì)的提取

參照邵敏蛋白提取方法略有改進，將枯草芽孢桿菌L1接種于KB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜作為種子液，按1％接種量轉(zhuǎn)接于KB液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL／300 mL三角瓶)，28℃170 r／min培養(yǎng)48 h；發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，再通過細菌濾器除去菌體，收集濾液；抗菌粗蛋白質(zhì)采用(NH₄)₂SO₄分級沉淀法提取，7個硫酸銨梯度分別為：0～30％(含30％)、30％～40％(不含30％)、40％～50％(不含40％)、50％～60％(不含50％)、60％～70％(不含60％)、70％～80％(不含70％)、80％～100％(不

含80％)沉淀蛋白；4℃8 000 r／min離心20 min收集沉淀，溶于適量10 mmol／L的磷酸鈉鹽緩沖液(PBS，pH8.0)中；將蛋白溶液裝入處理好的透析袋(截留分子量12 000 D)中，4℃下用同緩沖液透析脫鹽。離心棄不溶性沉淀，上清液即為抗菌粗蛋白，用于抑菌活性檢測。

1．4．2抗菌粗蛋白質(zhì)對水稻紋枯病菌抑菌作用的測定

準備好PDA平板，在距離PDA平板中央3 cm處用內(nèi)徑為0.7 cm的打孔器在對稱的方向上打2個孔，取0. 03 mL上述分級提取的抑菌粗蛋白注入每個孔中，然后在此PDA平板中央接種直徑為0.7cm水稻紋枯病菌菌碟，以無菌水為對照，每個處理3個重復(fù)，26℃培養(yǎng)72 h后測量抑菌的半徑，分析比較差異顯著性。

1．5枯草芽孢桿菌L1對部分植物種子和果實致病性的測定

將枯草芽孢桿菌L1接種到KB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后稀釋1倍備用。

玉米、小麥、水稻、大豆種子100粒采用枯草芽孢桿菌L1培養(yǎng)液浸泡1 h，取出晾干后催芽；而番茄和菜豆采用整個果實，黃瓜切成厚度為2 cm的圓片測定，浸泡1 h，取出晾干，然后放入封口袋中保濕，無菌水處理為對照，26℃保存4 d，觀察形態(tài)變化。

2結(jié)果與分析

2．1枯草芽孢桿菌L1抑菌譜的測定

采用菌絲生長速率法，測定枯草芽孢桿菌L1對9種植物病原真菌菌絲生長的影響，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，枯草芽孢桿菌L1對這9種植物病原菌都有一定的拮抗作用，其中對水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果較好，拮抗最長半徑(cm)與最短半徑(cm)3次平均值分別為2.17、2.90、2.27、2.03、2.20。

2．2不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌絲生長的影響

對枯草芽孢桿菌L1進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定該菌株分泌抗菌次生代謝產(chǎn)物達到平衡的時間，對培養(yǎng)菌株L1不同時間取樣，進行濕熱滅菌，采用菌絲生長速率法測定其對水稻紋枯病菌抑菌效果，加無菌水作為對照，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，枯草芽孢桿菌L1不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液經(jīng)滅菌處理后，對水稻紋枯病菌菌絲抑制率存在差異，培養(yǎng)5 d與6、7、10 d的發(fā)酵液抑制率差異不顯著，而與4 d之前的發(fā)酵液存在顯著差異，說明培養(yǎng)5 d時發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)含量達最高，達83.23％，隨時間延長抑菌效果不再增加。

2．3不同溫度處理發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌絲的影響

測定枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細菌濾器過濾后，20℃、-20℃處理24 h，121℃處理20 min后，無菌水為對照，測定抑菌直徑，結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液經(jīng)20℃、-20℃和121℃分別處理后，菌株L1發(fā)酵液的抑菌效果在0.01水平上差異不顯著，說明枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響較小，對溫度不敏感。

2．4抗菌粗蛋白對水稻紋枯病菌菌絲生長的影響

抗菌粗蛋白質(zhì)采用(NH₄)₂SO₄分級沉淀法提取后，測定其對水稻紋枯病菌的抑菌作用，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，硫酸銨粗蛋白分離純化后的7個梯度的粗蛋白對水稻紋枯病菌菌絲均具有一定的抑制作用，其中硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)和其他梯度的存在顯著差異，其抑制效果最好，平均抑菌半徑達1.15 cm，說明枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)中，其活性物質(zhì)有待于進一步深入研究。

2．5枯草芽孢桿菌L1對部分植物種子和果實致病性的測定

為測定枯草芽孢桿菌L1對田間其他作物是否有致病能力。觀察其致病性。用枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液對玉米、大豆、小麥、水稻種子及番茄、菜豆、黃瓜果實進行浸泡處理，果實96 h、種子待發(fā)芽后觀察表觀特征，結(jié)果見表5。

從表5結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌L1對玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻均無致病作用，而且對小麥、水稻種子發(fā)芽和生長有促進作用，對黃瓜和番茄有一定的保鮮作用，其機制有待于進一步深入研究。

3結(jié)論

枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜比較廣，尤其對水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果較好。

枯草芽孢桿菌L1不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液經(jīng)濕熱滅菌處理后，對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制率存在差異，培養(yǎng)5 d發(fā)酵液與6、7、10 d的差異不顯著，而與4 d以前的差異顯著，說明培養(yǎng)5 d時培養(yǎng)液中抑菌物質(zhì)含量達到平衡，抑菌效果最好，抑菌率為83.23％。

枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液經(jīng)20℃、-20℃和121℃分別處理后，其對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制率在0.01水平上差異不顯著，說明枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響不大，對溫度不敏感。

采用硫酸銨梯度沉淀法沉淀枯草芽孢桿菌L1分泌的蛋白，7個梯度沉淀的蛋白對水稻紋枯病菌生長的影響不同，其中硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)抑菌效果最好，平均抑菌半徑達1.15 cm，說明枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)沉淀的蛋白。

枯草芽孢桿菌L1對玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻無致病性。

4討論

枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜廣泛，且對多種田間作物重要病原菌有較好抑制效果，為芽孢桿菌L1的進一步應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌L1培養(yǎng)5 d時培養(yǎng)液中抑菌物質(zhì)含量達到平衡，抑菌效果最好，隨時間延長其分泌的抑菌活性物質(zhì)不再增加，抑菌活性物質(zhì)對溫度不敏感，該特性對菌株L1的開發(fā)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

從上述表2和表3可以看出，枯草芽孢桿菌L1發(fā)酵液直接滅菌和用細菌濾器過濾菌體后進行滅菌，前者抑菌效果明顯高于后者，說明枯草芽孢桿菌L1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能還有胞內(nèi)物質(zhì)，下一步進行深入研究。

枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)，在其他飽和度下也有抑菌物質(zhì)存在，說明枯草芽孢桿菌L1產(chǎn)生并非一種抑菌活性物質(zhì)，抑菌活性物質(zhì)的種類和數(shù)量有待于進一步研究。

枯草芽孢桿菌L1對多種作物無致病能力為該菌株今后能在田間進行下一步試驗提供保證；另外，枯草芽孢桿菌L1對黃瓜和番茄有一定的保鮮作用，且對灰霉病菌也有較好的拮抗作用，因此可以向蔬菜保鮮劑方面進行擴展。