煙草赤星病菌菌種保存及致病性研究

易　龍

摘要：在煙草赤星病抗性鑒定和生防菌劑篩選工作中，常因菌種在室內連續多代移植培養導致菌株的致病力衰弱，而影響測定結果的準確性和一致性。對此，本研究嘗試將赤星病菌種經Richards培養液制備成菌層，置于4℃低溫環境條件下長期保存，連續5年測定其培養性狀和致病力，與連續轉代培養方法保存的菌種進行比較，結果表明在連續5年的試驗過程中，Richards法保存的菌種在培養性狀和致病性上沒有發生衰退，該菌種保存方法制作簡單、經濟、可靠，適用于煙草品種抗赤星病鑒定和生防菌劑的篩選工作。

關鍵詞：煙草赤星病菌；菌種保存；致病性

中圖分類號：S 435．72

煙草赤星病是煙葉成熟后期重要的葉部真菌性病害，是煙草生產上威脅最大的病害之一。該病具有潛育期短、流行速度快的特點，在環境條件適宜的情況下，短時間內即可造成大流行，給煙葉生產帶來巨大損失。自1892年首次報道煙草赤星病以來，曾幾次給世界煙葉生產帶來巨大的經濟損失。我國1916年首次在北京附近發現，1964年山東煙區大流行，損失很大，隨后此病在全國各煙區日趨嚴重。1989-1991年，河南省平均每年因赤星病造成煙草損失達2 300萬元，成為毀滅性的病害。2000年8月美國康涅狄格州和馬塞諸塞州，煙草赤星病大暴發，兩州煙草減產75％和89％。目前對赤星病主要靠化學藥劑進行治理，隨之帶來的農藥殘留、病原菌抗藥性以及影響卷煙衛生等問題，限制了農藥的大規模應用。生產實踐證明，選育種植抗病品種和篩選生防菌劑是控制赤星病經濟、安全、有效的途徑。

鑒定煙草品種對赤星病抗性以及篩選菌劑都應選擇可用于人工接種的代表性菌株。由于煙草赤星病菌菌株問的致病力存在分化現象，故在對煙草赤星病進行試驗中，一般選用致病性較強，且穩定一致的病原菌，常規菌種保存方法——連續轉代培養，因頻繁繼代培養，常導致菌株致病力逐漸衰弱，而直接影響抗病性鑒定結果和生防菌劑篩選的準確性與一致性。

本試驗旨在通過由Richards法制備在低溫條件下保存的煙草赤星病菌菌層，對其培養性狀和致病力進行觀察和測定，尋求一種簡單、經濟、可靠的赤星病菌種制作保存方法，有利于煙草赤星病抗病育種和生防菌劑篩選工作的有效開展。

1材料和方法

1．1供試材料

1．1．1供試菌株

煙草赤星病菌菌株Tbs3于2001年在重慶煙區采集的典型病斑上單孢分離獲得，經鑒定具有較強致病力。

1．1．2供試煙草品種

烤煙品種K326，種子由云南省煙草科學研究所提供，幼苗在溫室培育至15～16片真葉。

1．2試驗方法

1．2．1赤星病菌種制作

用1％硝酸鉀、0.5％磷酸二氫鉀、0.25％硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)、5％蔗糖、0.02‰氯化鐵組成的Richards培養液進行赤星病菌的靜置培養，10 d后培養觀察性狀，用無菌水洗凈附著在菌層上的營養物質后平攤在濾紙上，無菌條件下放置24 h，陰涼保存。

1．2．2赤星病菌菌株培養性狀觀察

2002-2006每年10月份，將上述保存的菌種(命名為Tbs3-R)同常規每隔3個月連續轉代保存于PDA斜面上的菌種(命名為Tbs3-c)轉接于PDA平板上，置于26℃恒溫培養，將菌種活化后分別挑取直徑5 mm大小的菌塊轉到PDA平板中央，置于26℃恒溫箱中培養，于3、5、7 d后測量菌落的增長直徑，每菌株設5個重復，每重復為一皿。待皿內菌絲長滿以后，觀察菌絲的色澤變化。同時取赤星病菌孢子用無菌水配制為2.5×10⁵個／mL孢子懸浮液，26℃培養，6、12、24 h后鏡檢其孢子的萌發，以芽管長度超過分生孢子小端直徑1／2時記錄為萌發，每處理重復3次，計算孢子萌發率。

1．2．3兩種方法保存菌株的致病力比較

將兩種方法保存的菌株Tbs3-R、Tbs3-C進一步在溫室盆栽條件下測定對煙草的致病性，將各菌株培養7 d后，用1％無菌葡萄糖溶液配制成2.5×10⁵個／mL孢子懸浮液，每菌株重復3次，每重復處理5株幼苗，每株接種第4～6片真葉，每葉接種12滴，每滴25 μL，接種后26℃保濕培養5 d，以無菌水處理為對照。

統計各菌株的葉片接種位點發病率、發病嚴重度和病情指數，結果用SPSS12.0軟件進行統計分析。發病嚴重度分級標準及病菌致病力強弱分化標準見表1。

2結果與分析

2．1赤星病菌種制作結果

菌種經靜置培養10 d后在液體表面形成茶色或棕色菌層，用無菌水洗凈附著在菌層上的營養物后平攤在濾紙上放置24 h，可形成許多暗綠色的分生孢子，于4℃條件下陰涼保存。

2．2兩種方法保存菌種的孢子萌發和菌落生長

兩種方法保存的菌種孢子萌發率及菌絲生長率見表2。從2001年通過單孢分離獲得的赤星病菌菌種連續轉代培養的菌株Tbs3-C，以及由Richards法培養的菌層低溫保存的菌種Tbs3-R，經連續5年的檢測發現，Tbs3-C同Tbs3-R相比，菌種在保存兩年后孢子萌發率有顯著降低，同時菌絲生長緩慢，菌落多呈不規則形、色澤不均，而Richards法制作的菌層保存的菌種Tbs3-R并無明顯變化，孢子萌發和菌絲生長正常，菌落呈近圓形、墨綠色。

2．3兩種保存方法菌種的致病力比較

試驗結果表明，在連續5年的致病力測定中，轉代培養的菌種Tbs3-C致病力變化最為明顯，在保存時間兩年內(2002、2003年)的檢測中，致病力變化不大，菌株致病力仍然較強，而在保存3～4年(2004、2005年)的菌株接種位點發病率逐漸降低，致病力已發生明顯的衰退，與前期菌種在致病力上已存在明顯的差異，連續保存至第五年(2006年)，菌株致病力急劇衰弱，而Richards法菌層保存的菌種Tbs3 R在致病力等方面無明顯變化，結果見表3。

從上述結果可以看出，菌層保存的菌種未經任何轉代，一直保存于4℃低溫條件下，每次試驗取少量菌種活化進行試驗，在連續5年(5次)的測試過程中，Richards法保存的菌種Tbs3-R比常規PDA斜面連續轉代保存的菌種Tbs3-C致病力強，導致Tbs3-C生長勢及孢子萌發率降低原因可能在PDA試管保存過程中經過連續轉代后，其生長等方面衰變，同時致病力降低。

3討論

通過對Richards和常規菌種連續轉代培養兩種方法保存的菌株培養性狀和致病力測定表明：由Richards法保存的煙草赤星病菌菌種Tbs3-R在4℃條件下能夠長時間保存，其致病力沒有發生衰退。這種制作保存方法較之常用的PDA斜面試管保存法更為經濟簡單、省事省時，不需要特殊設備，只要把液體培養過程中得到的菌層晾干，放在陰涼處，即可長期保存，又可按試驗要求隨時制取具有強病原性的新鮮孢子，可為煙草赤星病鑒定選擇提供致病力穩定的菌株，從而保證年際間抗性鑒定結果的可比性、一致性和可靠性。

由常規連續轉代培養的菌種Tbs3-C在室內培養過程中，菌絲生長發育、孢子萌發率較Tbs3-R緩慢，室內接種葉片致病力有所減弱，在PDA試管保存過程中，經多次轉管后容易發生變異，同時菌絲生長易于老化，產毒素能力降低，可能是造成致病力降低的原因之一，該菌株其他生理生化變異需進一步深入研究。

煙草赤星病菌是一類弱寄生菌，為煙草成熟后期重要病原真菌，而新葉對其幾乎是免疫的，所以寄主品種的抗病性鑒定和室內生防菌劑的篩選都應采用致病力較強的菌株，本試驗還檢測出煙草赤星病菌在常規PDA斜面上的保存時間大概為兩年左右，超過上述期限，菌株的致病力將明顯衰退，而Richards法可為實際應用提供至少在5年內致病力保存方法能否推廣應用到其他真菌的保存以及用此種方法可以保存的最長年限，尚待進一步研究證實。