侵染葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒廣西分離物分子鑒定

秦碧霞　蔡健和　劉志明　魏源文　謝　玲　朱桂寧

摘要：從廣西南寧市郊溫室大棚中的葫蘆[Lagenaria siceraria(Molina)stand.]上采集到一個(gè)表現(xiàn)脈綠、花葉癥狀的病毒樣品，ELISA檢測表明，該樣品與黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)有密切的血清學(xué)關(guān)系，利用RT-PCR方法從樣品中擴(kuò)增獲得約500bp的DNA片段，序列分析表明，該片段是CGMMV的外殼蛋白基因，暫將該病毒分離物定名為GX-BG。外殼蛋白基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，已報(bào)道的CGMMV主要分為3大群體，GX-BG與中國遼寧分離物(CGMMV-LN)分別屬于不同的群體。

關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；外殼蛋白基因；序列分析；鑒定

中圖分類號(hào)：S 436．429

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mo-saic virus，CGMMV)最早在英國的黃瓜上被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，主要分布在歐洲、印度、日本等地的葫蘆科植物上，曾在一些國家和地區(qū)造成嚴(yán)重危害。2005年秦碧霞等在中國首次報(bào)道CGMMV侵染廣西觀賞南瓜，本文報(bào)道侵染廣西葫蘆的CGMMV分離物分子鑒定及其外殼蛋白基因序列分析。

1材料和方法

1．1試驗(yàn)材料

表現(xiàn)脈綠、花葉癥狀的葫蘆葉片采自廣西南寧市郊溫室大棚；西瓜花葉病毒(Watermelon mosaicvirus，WMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)和黃瓜花葉病毒(Cu-cumber mosaic virus，CMV)抗血清分別由Dr.Piero Roggero(Istituto Fitovirologia Applicata，CNR，Ita-ly)、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所惠贈(zèng)；南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus，SqMV)和CGMMV抗血清購自美國Agdia公司，山羊抗兔IgG-AP、山羊抗小鼠IgG-AP購自華美生物工程公司；Trizol為北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Ex Taq聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)、dNTPs等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1．2ELISA檢測

用抗原直接包被間接ELISA法(DAC-ELISA)檢測WMV、ZYMV、CMV、SqMV和CGM-MV。

1．3RT-PCR

1．3．1總RNA的提取

總RNA提取按Trizol試劑使用說明書進(jìn)行，RNA溶于30 μL DEPC水中備用。

1．3．2RT-PCR

用oligo(dT)為引物，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已報(bào)道的CGMMV外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)PCR特異引物，正向引物Pf：5-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3，反向引物Pr：5-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC-3，擴(kuò)增片段約500 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件參照陳紅運(yùn)等。用1％瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1．3．3序列測定及分析

取PCR產(chǎn)物(編號(hào)為GX-BG)直接送上海英駿生物技術(shù)有限公司克隆測序，序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析采用Vector NTI suite和DNAMAN軟件，用于序列分析的外殼蛋白基因分別來自廣西分離物(GX-G，DQ647384；GX-BG)、遼寧分離物(LN，DQ217778)、日本分離物(W，AB015146；SH，D12505)、巴基斯坦分離物(PK，AB127937)、印尼分離物(ID，AB194531)、韓國分離物(K-w，AF225984；KW，AF417242；KOM，AF417243；NS，AJ243831；Y，AJ245440)、法國分離物(Fr，AJ429090)、希臘分離物(GR3，AJ459421；GR5，AJ459422；GR7，AJ459423)和印度分離物(BT，AY309021)。

2結(jié)果

2．1ELISA檢測結(jié)果

經(jīng)DAC-ELISA檢測，葫蘆病樣與CGMMV抗血清呈陽性反應(yīng)，與WMV、ZYMV、CMV、SqMV抗血清呈陰性反應(yīng)。

2．2RT-PCR

用CGMMVcP基因引物從葫蘆病葉的總RNA中擴(kuò)增出一條約500 bp的特異性片段，與預(yù)期片段大小一致，而健康的葫蘆葉片無預(yù)期片段出現(xiàn)(圖1)。

2．3序列分析

序列分析表明，GX-BG的CP聲基因由486個(gè)堿基組成，編碼161個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的其他CGMMV分離物相同。GX-BG與其他16個(gè)分離物的cp基因核苷酸序列同源性均大于90％，與GR5的同源性最低(91.2％)，與LN的同源性達(dá)98.1％，與GX-G的cp基因核苷酸序列完全相同。cp聲基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明(圖2)，這些分離物分為3個(gè)主要的進(jìn)化相關(guān)群體，廣西分離物(GX-BG和GX-G)與印度(BT)、希臘(GR7)、日本(W)、法國(Fr)、巴基斯坦(PK)的分離物形成一個(gè)簇群，其中與W和Fr關(guān)系較密切，序列同源性99.4％；遼寧分離物(LN)則與印尼(ID)、日本(SH)、韓國(KW、NS、Y、KOM、K-W)分離物進(jìn)化成另一簇群，希臘的兩個(gè)分離物(GR3和GR5)則獨(dú)立成一簇。

GX-BG與其他16個(gè)分離物的cp氨基酸序列同源性均大于98％，其中與GR7、Y的同源性為98.8％，與PK、GR3、GR5的同源性為99.4％，與其余11個(gè)分離物的cp氨基酸序列完全相同。

3結(jié)論和討論

ELISA檢測和序列分析結(jié)果表明，在廣西南寧市郊大棚里侵染葫蘆引致脈綠和花葉癥狀的病毒病原是黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)，本研究從分子水平上進(jìn)一步證實(shí)了CGMMV在廣西葫蘆科作物上的存在。在進(jìn)化關(guān)系上，GX-BG與GX-G、BT、GR7、W、Fr、PK分離物形成一個(gè)簇群，與GX-G cp基因核苷酸序列完全一致，與W和Fr關(guān)系密切，而與中國遼寧分離物(LN)不屬于一個(gè)簇群，這可能與各分離物的地域分布及種子來源不同有關(guān)。GX-BG與GX-G、LN、W、SH、K-W、KOM、NS、Y、Fr、GR7和BT的cp氨基酸序列完全相同，它們可能有共同的起源。

CGMMV是侵染葫蘆科植物的重要病毒之一，對(duì)生產(chǎn)影響較大，極易通過汁液摩擦傳染，帶毒種子、種苗調(diào)運(yùn)是遠(yuǎn)距離傳播的主要方式。2006年我國農(nóng)業(yè)部(農(nóng)業(yè)部公告第788號(hào))已將該病毒確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物，我國臺(tái)灣、廣西、遼寧等地先后報(bào)道了該病毒，但目前僅在局部范圍發(fā)生，各地政府、檢疫及植保部門應(yīng)高度重視，及時(shí)采取有效措施，從源頭上控制該病毒，避免擴(kuò)散傳播，確保我國葫蘆科作物的安全生產(chǎn)。