枇杷花腐病病原物的初步鑒定

瞿付娟　竇彥霞　肖崇剛　董國菊

摘要：經調查發現，在重慶發生的枇杷花腐病癥狀有2種類型：干腐型和濕腐型。通過病原菌形態特征、培養性狀和致病性測定，初步鑒定這兩種癥狀分別由擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起。枇杷花腐病害的發生與環境濕度有關，且濕度越大，病害發生越嚴重。

關鍵詞：枇杷；花腐病；病原鑒定；濕度

中圖分類號：S 436．6

枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind.]為薔薇科常綠喬木果樹，原產中國，栽種歷史悠久。近年來，枇杷在重慶的種植面積不斷增加，隨著生產規模日益擴大，枇杷上相繼暴發各種病害，尤其是枇杷花腐病的發生，嚴重制約了枇杷的正常生產。據調查，花腐病帶來的后果是災難性的，嚴重時發病率可達97.4％。引起枇杷花腐的病因，鄭少泉等認為在花期或果實成熟期，枇杷灰霉病可發生，病原菌為Botrytis cinerea Pers；肖宇等認為灰霉菌不是引起花穗腐爛的關鍵性致病病原菌，認為是在花腐病的中后期腐生上去的；但到目前還沒有比較詳細的研究報道。為進一步掌握枇杷花腐病害發生發展規律，明確引起病害發生的主要病原種類，筆者在2004年9月至2006年12月對重慶枇杷進行了全面的調查研究，現將結果報道如下。

1材料與方法

1．1枇杷花腐病標本來源

2004年9月至2007年1月期間，在重慶九龍坡、合川、永川、壁山等6個大型枇杷生產基地，采用系統抽樣和隨機采集相結合的方法調查枇杷花腐病病害發生情況，并以大五星枇杷為例，在同一田間，每月隨機抽取大五星枇杷10株，調查枇杷花腐發病情況與當地空氣濕度的關系。其中當地空氣的濕度由干濕球溫度表測得。

1．2 病原菌的分離

選取不同采集地新鮮且具典型癥狀的枇杷花腐病花枝，對其進行常規組織分離純化，分離的菌株經單孢純化后保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中貯存備用。

1．3病原菌致病性測定

采用離體花枝接種法。在枇杷開花季節，采集感病品種大五星的健康花枝，插于盛水三角瓶中，每日換水1次，用孢子懸浮液(5×10²個／mL)進行噴霧離體接種，在25℃連續光照的條件下進行保濕培養，以清水作為對照，共設置90枝枇杷花枝重復。保濕24 h后，觀察發病情況。根據柯赫氏法則，對發病花朵進行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病原菌是否與原接種菌株相同。

2結果與分析

2．1田間調查

200 4年9月至2007年1月期間，在枇杷花盛開季節，共調查枇杷1 086株，其中株病花率達到50％的有519株，且不同品種花腐病發病程度不同。其中大五星及龍泉一號品種的枇杷花穗腐爛最多，在調查的246株大五星枇杷和213株龍泉一號枇杷發病率分別達到63.1％和62.7％，說明大五星和龍泉一號為易感花腐病的品種；同一品種在不同濕度下發病程度也不同(圖1)。圖1是以大五星枇杷為例，用Excel軟件對所得數據進行統計分析，繪出的2004年9月至2007年1月期間枇杷花腐病每月發病率和月平均濕度圖。結果表明，凡雨季來臨早或雨量大或雨日多的年份，濕度大，發病早，傳播蔓延快，危害嚴重。特別是在2004年9～12月雨水特別多，濕度大，此時正值枇杷開花之季，重病果園區發病率高達99.7％，形成有花無果，直接影響了枇杷的座果率；而2006年重慶干旱嚴重枇杷花腐發病率明顯降低。

2．2病害癥狀

在9月下旬，花腐病就開始危害枇杷花蕾，調查發現花腐病癥狀有2種類型。一種是干腐型：花軸表皮變褐，再沿花軸逐漸向整個花蕾擴展，從花軸變褐部分至花朵皺縮干枯呈萎蔫狀，后脫落，在后期花朵脫落后，花軸和花朵基座上產生黑色小點(圖2a)，經鏡檢黑色小點是分生孢子盤及分生孢子(圖2b)。另一種癥狀是濕腐型：花軸組織軟腐，呈粑爛狀，濕度大時，上面常有灰色霉狀物出現。花蕾發病，病斑灰黑色，可阻止花開放，病蕾變褐枯死，花受侵害時，部分花瓣變褐色皺縮腐爛。在溫暖潮濕的環境下，灰色霉層可以完全長滿受侵染的部位(圖2c)。

2．3病原菌培養性狀

無論從新鮮的枇杷花腐病組織中分離純化，還是采用病花枝上孢子挑取進行分離純化，結果一致，且都得到2種菌：記為PF-1和PF-2。現將其特征分別描述如下：

PF-1在PDA上培養時，菌絲體絨狀松軟，早期呈輪紋狀。培養8～10 d后，菌絲體上產生分生孢子盤，分布于整個菌落(圖3a)；分生孢子盤(圖3b)呈球形，直徑150～280 μm，頂端有墨汁狀黏液即產生的分生孢子；分生孢子成熟后直立或稍彎曲，廣梭形，長17.9～24.8μm，寬6.4～8.1 μm，具5個細胞，長22～26 μm，中間3個細胞有色，長14～17 μm，分隔處不具顯著縊縮；頂部細胞短而無色，基部細胞較小；有鞭毛3根，有時僅有2根，長16.8～30.1 μm；柄長2.97～7.01 μm(圖3c)。PF-2在PDA平板上培養形成淡褐色菌落，氣生菌絲稀疏，易產孢，在PDA能形成菌核，直徑2.5～6.3 mm，單生，圓形至長圓形(圖3d)。肉眼可見的灰棕色霉層就是該菌絲體和分生孢子梗及成堆的分生孢子，分乍孢子梗淡褐色不分支，可進行1～5級的亞分支，和主軸呈變化較大的銳角，頂端明顯膨大，梗粗長(圖3e)；分生孢子葡萄狀堆集在梗末端，單孢，卵圓或側圓形，末端稍突。無色至淡橄欖色，大小8～14 μm×6～9 μm(圖3f)。

2．4病原菌致病性測定

在接種病原菌PF-1的30枝枇杷花穗中，第3天出現花軸表皮變褐病癥的有23株，發病率達到76.7％，一旦花軸變褐，變褐部位擴展速度很快，第4天，花朵皺縮干枯呈萎蔫狀，第6天，花朵脫落，第8天，變褐部位和脫落后的花朵基座上產生黑色小點。在試驗過程中，對照均未發病。

在接種病原菌PF-2的30枝枇杷花穗中，第3天出現花軸表面腐爛病癥的有19株，發病率達76.7％，第4天花朵變褐，皺縮。第6天花朵腐爛，花軸至花朵長滿灰色霉層。在試驗過程中，對照均未發病。

無論病原菌PF-1還是病原菌PF-2的接種試驗均表明，病斑同原分離菌所在病斑形態特征一致，且從接種菌產生的病斑再次保濕和在PDA培養基上分離培養后顯微鏡觀察，其結果仍為原分離菌，因此證實了原接種菌株為致病菌。

2．5病原菌的鑒定

根據上述菌株的形態特征，結合致病性測定，并參照相關文獻，確定病原菌PF-1為擬盤多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba) chen et

Cao]；病原菌PF-2為灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers.)。

3結論與討論

通過跟蹤調查重慶枇杷花腐病害的發生，發現濕度越大，枇杷花腐病害發生越嚴重，從病理角度分析，病原物與寄主的接觸和侵入都和濕度及雨水等氣象條件有關，絕大部分靠氣流傳播的真菌，濕度越高對病原菌的侵入越有利。因此，盛花期的陰雨天氣是導致花腐病發生的重要環境因素。

擬盤多毛孢屬及相關屬是從盤多毛孢屬分離出來的。值得提出的是，擬盤多毛孢屬及其相鄰屬的分類目前依然處于比較混亂的局面。傳統的擬盤多毛孢屬分類多數以Guba的檢索表為依據，該檢索表包含了前人發表過的種，但種間特征模棱兩可，steyaert年建立了擬盤多毛孢屬(Pesta-lotiopsis]，他將原廣義盤多毛孢屬(Pestalotia)中分生孢子具5個細胞，中間3個細胞深色的種歸入Pestalotiopsis中。Sutton和Nag Raj先后對擬盤多毛孢屬的特征作不同的界定，兩個分類系統矛盾的焦點在于對擬盤多毛孢屬和截盤多毛孢屬等屬的界定不同，韋繼光等通過分子系統學研究證明sutton界定的屬間特征是合理的。即擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)分生孢子具有5個細胞，頂端多根附屬絲，附屬絲不分支或非二叉分支；截盤多毛孢屬分生孢子4個細胞，具有多根頂端附屬絲。陳國貴等鑒定出引起枇杷葉片灰斑病的病原菌是盤多毛孢屬。按照其病原菌形態描述特征，陳家云認為引起枇杷灰斑病的病原菌是擬盤多毛孢[Pestalotiopsiseriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]。因此本試驗參照上述鑒定標準及從分離的代表菌株的形態、培養性狀和致病性測定進行綜合分析認為，引起枇杷花腐病干腐癥狀的病原菌為擬盤多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia (Guba) chen etCao]。枇杷花腐病在我國的報道很少，陳福如等報道在花穗成熟期灰葡萄孢菌可侵染，而肖宇等僅僅報道枇杷花腐病可能是由擬盤多毛孢菌引起的，本文首次全面報道引起枇杷花腐病的病原菌為擬盤多毛孢(P.eriobotrifolia)和灰葡萄孢(B.cinerea)，為枇杷花腐病害防治打下了理論基礎。本文為該項研究的部分試驗結果，今后將對該病的生物學特性和綜合防治作進一步研究。