高濃度ＣＯ_２氣調(diào)脅迫對(duì)藥材甲老熟幼蟲(chóng)磷酸酯酶活力的影響

李　燦　李子忠　鄭興旺　周　波　曹　宇

摘要：用高濃度CO₂氣體脅迫處理藥材甲老熟幼蟲(chóng)及體外磷酸酯酶，通過(guò)終點(diǎn)法測(cè)定酶活性變化，分析氣調(diào)脅迫與磷酸酯酶活性變化之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，高濃度CO₂密閉處理藥材甲老熟幼蟲(chóng)6 h和12 h，ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，ALP活力分別降低了7.69％和7.91％。ACP經(jīng)CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強(qiáng)92.77％、127.43％和67.91％。可見(jiàn)，高濃度CO₂氣調(diào)脅迫處理對(duì)藥材甲老熟幼蟲(chóng)ACP和ALP活力均有一定影響。

關(guān)鍵詞：藥材甲；高濃度CO₂氣調(diào)；磷酸酯酶；比活力

中圖分類號(hào)：Q 965．9

儲(chǔ)藏產(chǎn)品，尤其是直接供人畜食用或藥用的產(chǎn)品害蟲(chóng)防治策略與大田農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治策略有根本的區(qū)別，前者對(duì)農(nóng)藥殘留問(wèn)題更為重視。藥材甲[Stegobium paniceum(L.)]隸屬于鞘翅目(Coleop-tera)竊蠹科(Anobiidae)，是一種典型的世界性分布儲(chǔ)藏物甲蟲(chóng)，近年在貴陽(yáng)地區(qū)發(fā)生和為害猖獗，藥業(yè)損失嚴(yán)重。該蟲(chóng)是最常見(jiàn)的中藥材儲(chǔ)藏期害蟲(chóng)之一，已有研究證明利用高濃度CO₂和低濃度O₂協(xié)同作用來(lái)控制儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)安全可行、健康環(huán)保，作者嘗試了高濃度CO₂氣調(diào)在中藥材害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用，開(kāi)展了藥材甲氣調(diào)毒理學(xué)的基礎(chǔ)研究。

酯酶性質(zhì)的研究一向是昆蟲(chóng)毒理學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，磷酸酯酶因其在昆蟲(chóng)抗藥性發(fā)展中的作用也受到許多關(guān)注。磷酸酯酶有酸性磷酸酯酶(acid phosphatases，ACP)和堿性磷酸酯酶(alkalinephosphatases，ALP)兩類，分別在相應(yīng)的酸堿性條件下，能夠水解對(duì)硝基苯基磷酸二鈉產(chǎn)生黃色物質(zhì)對(duì)硝基苯酚。生物組織損傷會(huì)影響到ACP所在腸道的正常生理平衡，進(jìn)而影響到該酶的活性，導(dǎo)致機(jī)體中毒。有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類以及其他外源性有毒物質(zhì)均能引起該酶活性的變化。顏增光等的研究表明，高濃度的光活化毒素a-三噻吩(a-ter-thienyl，a-T)對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的ACP和ALP離體活性均有抑制作用。Nathan等的研究表明，印楝素和核多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus)能夠抑制斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中腸的兩種磷酸酯酶的活性，檸檬苦素(limonoids)對(duì)稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)幼蟲(chóng)和蛹期的ALP和ACP具有相同的作用。

本研究將CO₂作為外源毒物，通過(guò)高濃度脅迫處理藥材甲老熟幼蟲(chóng)，比較研究氣調(diào)處理前后磷酸酯酶活性的變化，以期為氣調(diào)殺蟲(chóng)機(jī)理的研究以及昆蟲(chóng)抗氣性治理提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1．1供試蟲(chóng)源

藥材甲于2002年采自貴陽(yáng)市藥材公司，在人工氣候?qū)嶒?yàn)室(29±1)℃、相對(duì)濕度(75±5)％、光照14h條件下飼養(yǎng)，以中藥材狼毒(Radix euphorbiae Fis-cherianae，購(gòu)自貴陽(yáng)市藥材公司)為食料。試驗(yàn)時(shí)已人工飼養(yǎng)15代以上，以3～4齡老熟幼蟲(chóng)作為試蟲(chóng)。

1．2主要化學(xué)試劑及儀器設(shè)備

對(duì)硝基苯基磷酸二鈉(Merck)和對(duì)硝基苯酚為天津光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，巴比妥鈉為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)G-250為sigma產(chǎn)品，牛血清白蛋白為Roche產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Tecan產(chǎn))；高速冰凍離心機(jī)(sigma產(chǎn))。

1．3生物測(cè)定與昆蟲(chóng)氣調(diào)處理

同齡老熟幼蟲(chóng)60頭置于20 cm×30 cm×20 cm可充氣密閉塑料培養(yǎng)盒中，用氣體混配儀(長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司產(chǎn))通人CO₂和空氣的混合氣體，CO₂占75％，空氣占25％(體積比)，分別處理6～54 h，相同環(huán)境條件下空氣處理作為對(duì)照。死亡標(biāo)準(zhǔn)確定：處理昆蟲(chóng)移出氣調(diào)環(huán)境，室溫條件恢復(fù)6 h后，以毛刷子刺激不動(dòng)視為死亡。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4酶液提取與制備

本研究分別進(jìn)行了高濃度CO₂處理幼蟲(chóng)后提取酶液和對(duì)未處理過(guò)的昆蟲(chóng)提取酶液進(jìn)行體外處理兩類試驗(yàn)。前者酶液提取方法為：取老熟幼蟲(chóng)30頭，置于20 cm×30 cm×20 cm密閉培養(yǎng)盒中，通入高濃度CO₂氣體分別處理o h(置于空氣環(huán)境中，作為對(duì)照處理)、6 h和12 h(根據(jù)生物測(cè)定結(jié)果，處理時(shí)間內(nèi)死亡率在10％以下)，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷處理的pH 4.6，0.2 mol／L醋酸緩沖液0.4 mL，冰液充分勻漿，后加入7.6 mL相同緩沖液混勻，分裝于8支1.5 mL離心管，于10 000 r／min，4℃離心15 min，取上清液于4℃冰箱中保存，24 h內(nèi)使用。體外處理試驗(yàn)則將未經(jīng)CO₂處理的昆蟲(chóng)，直接如上述方法提取酶液，活性測(cè)定試驗(yàn)前，酶液用高濃度CO₂進(jìn)行體外處理。

堿性磷酸酯酶ALP的提取方法同ACP提取，將緩沖液改為pH 9.6，0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液即可。

1．5酶液體外處理

將未處理幼蟲(chóng)直接提取的酶液混勻分裝于4支相同的試管中，置于37℃恒溫水浴，持續(xù)通入高濃度CO₂氣體，流速100mL／min，分別處理30、60、120 min時(shí)測(cè)定酶活性，取等量酶液不通氣置于相同水浴溫度條件下，靜置對(duì)應(yīng)時(shí)間作對(duì)照處理。

1．6制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

用去離子水配制7.5 mmol／L對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，于8支5 mL試管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用0.2 m01／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，于37℃水浴靜置30 min后取出，加入0.2 mol／L氫氧化鈉溶液2.0 mL，室溫靜置10 min后于400 nm處測(cè)OD值。以對(duì)硝基苯酚濃度為自變量(x)，其在400 nm處的OD值為因變量(y)，回歸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)硝基苯酚在酸性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如上方法，將緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液，氫氧化鈉濃度調(diào)整為0.1 mol／L，制作對(duì)硝基苯酚在堿性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣，配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定不同濃度于595 nm處測(cè)定OD值，以牛血清白蛋白濃度作自變量(x)，其在595 nm處的吸光度值為因變量(y)，得到標(biāo)準(zhǔn)

曲線。

1．7酶活性測(cè)定和數(shù)據(jù)處理

參照Bradford等的方法，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定酶源蛋白含量，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Bessey的方法，用對(duì)硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。底物對(duì)硝基苯基磷酸二鈉在磷酸酯酶的作用下，水解生成對(duì)硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，于400 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定OD值。酶活性測(cè)定反應(yīng)體系中含5×10^-4mol／L對(duì)硝基苯基磷酸二鈉0.5 mL，酶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反應(yīng)總體積用0.2 mol／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，混合液于37℃恒溫水浴反應(yīng)30 min后，立即加入0.2 mol／L氫氧化鈉2.0 mL終止反應(yīng)(測(cè)定ALP活性時(shí)將氫氧化鈉濃度換為0.1 mol／L，緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉－鹽酸緩沖液)，室溫靜置10 min，于400nm處測(cè)定OD值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶源蛋白含量的測(cè)定結(jié)果，將酶液用量(mL)轉(zhuǎn)換成酶液蛋白含量(mg)，將酶活性測(cè)定結(jié)果的OD值換算為相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)硝基苯酚的量(μmol)，然后以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚的量(μmol)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸制作活力曲線，該曲線的斜率即為相應(yīng)ACP或ALP的比活力μmol／mg·(30 min)^-1。

2結(jié)果與分析

2．1生物測(cè)定

藥材甲老熟幼蟲(chóng)經(jīng)高濃度CO₂處理后，死亡率曲線如圖1所示。處理18 h內(nèi)，藥材甲幼蟲(chóng)死亡率均很低，多數(shù)處于昏迷狀態(tài)，移出處理環(huán)境6 h可復(fù)活，屬于“擊倒”不記人死亡。處理30 h時(shí)，平均死亡率升高至50％。經(jīng)回歸分析(SPSS 11.5，Probit Analysis)，半數(shù)死亡時(shí)間LT₅₀為30.022 h，95％置信限為28.588～31.426 h。可見(jiàn)，如果需要通過(guò)高濃度CO₂氣調(diào)處理來(lái)殺滅藥材甲幼蟲(chóng)，全面密閉處理48 h是必要的。實(shí)踐中還應(yīng)考慮藥材甲幼蟲(chóng)蛀食于藥材內(nèi)部為害的特點(diǎn)，因此，處理時(shí)間應(yīng)超過(guò)48 h。

2．2標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用

對(duì)硝基苯酚在酸／堿性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y_a=11.624 x+0.004，R²=0.999 3^**；yb=11.377 x+0.002，R²=0.998^**。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.018 6 x+0.026，R²=0.998^**，用作酶源蛋白含量定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。以上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均極顯著。

2．3藥材甲老熟幼蟲(chóng)高濃度CO₂脅迫下磷酸酯酶比活力

藥材甲老熟幼蟲(chóng)經(jīng)高濃度CO₂密閉處理6 h和12 h，其磷酸酯酶活力曲線如表1所示。曲線斜率即為相應(yīng)處理下的磷酸酯酶比活力。老熟幼蟲(chóng)在高濃度CO₂環(huán)境中密閉處理6 h和12 h，其ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，而ALP活力則分別降低了7.69％和7.91％。

2．4藥材甲老熟幼蟲(chóng)ACP酶液體外處理后酶活力

未經(jīng)高濃度CO₂處理之藥材甲老熟幼蟲(chóng)提取ACP，酶液經(jīng)體外持續(xù)通入高濃度CO₂氣體處理30、60、120 min，其活力曲線如表2所示。曲線的回歸方程斜率即為相應(yīng)處理下的ACP比活力。高濃度CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強(qiáng)92.77％、127.43％和67.91％。可見(jiàn)，藥材甲老熟幼蟲(chóng)ACP在高濃度CO₂體外處理下，其比活力有不同程度的升高。

3結(jié)論與討論

磷酸酯酶性質(zhì)的改變是導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷類等農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的原因之一，昆蟲(chóng)可以通過(guò)磷酸酯酶活性的增強(qiáng)來(lái)提高對(duì)外源性毒物的解毒能力，這種能力最終發(fā)展為抗性，昆蟲(chóng)對(duì)氣調(diào)處理產(chǎn)生抗性與若干酶的活性變化有關(guān)。過(guò)去人們對(duì)CO₂氣調(diào)處理對(duì)昆蟲(chóng)作用的研究，主要集中于通過(guò)CO₂與其他氣體的配比設(shè)計(jì)來(lái)提高對(duì)昆蟲(chóng)的殺傷效果，很少有研究關(guān)注CO₂氣調(diào)處理對(duì)昆蟲(chóng)生理生化活動(dòng)的影響，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有關(guān)CO₂氣調(diào)處理對(duì)藥材甲磷酸酯酶活力影響的正式報(bào)道。本研究中高濃度CO₂氣調(diào)處理藥材甲老熟幼蟲(chóng)可導(dǎo)致其磷酸酯酶活力的變化，高濃度CO₂氣體作用于藥材甲老熟幼蟲(chóng)機(jī)體，其體內(nèi)的ACP活性增強(qiáng)，ALP活性稍微受到抑制，高濃度CO₂對(duì)ALP和ACP活性作用不一致，可能與CO₂進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)富集后，改變了體液的酸堿性平衡有關(guān)，因pH降低，致使堿性磷酸酯酶活力受到抑制。

藥材甲老熟幼蟲(chóng)未經(jīng)CO₂處理提取ACP，酶液經(jīng)高濃度CO₂體外處理30～120 min，其比活力均顯著升高，這個(gè)結(jié)果與高濃度CO₂直接處理藥材甲幼蟲(chóng)相似，其差異在于體外處理的作用更明顯，說(shuō)明CO₂對(duì)藥材甲幼蟲(chóng)ACP確有激活作用。這一結(jié)果與其他已知的外源性毒物如a-T等對(duì)昆蟲(chóng)作用的方式不一致，a-T的作用抑制了ACP和ALP的活性，而高濃度CO₂作用雖然對(duì)ALP有輕微的抑制作用，但卻激活了ACP的解毒能力，可見(jiàn)，高濃度CO₂氣調(diào)的殺蟲(chóng)與a-T的作用機(jī)理可能是不同的。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于認(rèn)識(shí)氣調(diào)作用對(duì)儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)控制的作用機(jī)理有積極意義。