甘蔗花葉病抗病性鑒定接種新技術(shù)研究

李文鳳　黃應(yīng)昆　盧文潔　羅志明

摘要：研究了甘蔗花葉病抗病性鑒定的一種新技術(shù)甘蔗生長期切莖接種法。此法和傳統(tǒng)苗期手指摩擦接種法相比，接種后發(fā)病率極顯著地高于手指摩擦接種法，且發(fā)病均勻、結(jié)果穩(wěn)定，可以有效地區(qū)分不同甘蔗品種(材料)之間對病害的抗感性。比較11個甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田間自然感病法對srMV-HH1的抗性鑒定，結(jié)果表明：兩種方法發(fā)病率呈正相關(guān)，且相關(guān)程度極密切，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 7，鑒定所得的抗病性和抗病等級結(jié)果完全一致，說明切莖接種法鑒定結(jié)果能真實(shí)反映甘蔗品種材料的自然抗感性；此外該方法簡便實(shí)用、可操作性強(qiáng)、接種工效高，因此可以對大批量材料進(jìn)行鑒定和篩選。

關(guān)鍵詞甘蔗花葉病；接種新技術(shù)；生長期切莖接種法

中圖分類號：S 435．661

甘蔗花葉病是一種重要的世界性甘蔗病害。近年來，該病在我國福建、廣東、廣西、四川和浙江等蔗區(qū)普遍發(fā)生，目前已成為云南蔗區(qū)發(fā)生最為普遍，危害最為嚴(yán)重的主要病害。全省年發(fā)病面積達(dá)6.67萬hm²以上，其中嚴(yán)重發(fā)病面積達(dá)3.3萬hm²以上，且有逐年擴(kuò)展蔓延加重危害之趨勢。感病品種，發(fā)病嚴(yán)重田塊發(fā)病率高達(dá)100％。甘蔗感病后一般造成10％～40％的產(chǎn)量損失，糖分下降。其病原復(fù)雜，可由馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花葉病毒(Sbrghum mosaic virus，SrMV)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、約翰遜草花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、玉米花葉病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)、甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)等6種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染引起。此病主要靠蚜蟲、帶病蔗種和蔗刀等收砍工具傳播。國內(nèi)外大量的研究表明：對甘蔗花葉病最經(jīng)濟(jì)有效的控制方法，就是選用抗病優(yōu)良品種。因此對甘蔗種質(zhì)資源進(jìn)行抗性評價、篩選優(yōu)良抗源以指導(dǎo)培育抗病品種成為育種學(xué)家和植病學(xué)家共同的重要目標(biāo)。優(yōu)良抗源的篩選工作必須以數(shù)量多、范圍廣的甘蔗種質(zhì)資源抗性評價為基礎(chǔ)，因此急需研究建立一套快速簡便、致病性穩(wěn)定、規(guī)范、實(shí)用的抗性鑒定技術(shù)。

目前甘蔗種質(zhì)資源對花葉病的抗性鑒定方法有大田病圃鑒定、田間自然感病鑒定和人工接種鑒定。它們各具有優(yōu)點(diǎn)和局限，大田病圃鑒定和田間自然感病鑒定是最為普遍、直觀的方法。但其鑒定周期長、占用土地面積大、鑒定材料數(shù)量有限；而且由于病圃和田間中的自然病原及種類分布不均勻、氣候和傳播媒介等環(huán)境條件變化常常會影響鑒定結(jié)果的真實(shí)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。人工接種鑒定快速簡便、鑒定材料數(shù)量不受限制，且環(huán)境條件可人為控制，可以滿足大規(guī)模篩選抗源材料的需要。目前常用的人工接種方法有噴霧接種法、手指摩擦接種法。噴霧接種法主要用于大批量材料接種，手指摩擦接種法則用于小批量材料接種。但兩種方法都需要在接種時用手工搓揉蔗葉制造傷口，由于不易掌握搓揉力度，往往導(dǎo)致搓揉傷口不均勻，從而使接種后發(fā)病不均勻，致病性不穩(wěn)定，影響鑒定結(jié)果。此外，由于甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難，導(dǎo)致接種工效低。鑒于此，本研究在現(xiàn)有的、普遍采用的苗期接種技術(shù)基礎(chǔ)上，研究建立了甘蔗生長期切莖接種鑒定法，并與苗期手指摩擦接種鑒定法和田問自然感病鑒定法結(jié)果進(jìn)行比較。

1材料與方法

1．1供試甘蔗品種材料

供試甘蔗品種從本所脫毒健康苗圃選擇粵糖79-177、臺糖134、川糖61-408、粵糖89-240、云蔗89-151、桂11、Co281、cp31-588、拔地拉、ROC10、ROC22等品種無病健壯蔗株，各品種蔗株分別切成雙芽苗，在流動冷水中浸泡48 h之后，用(50±0.5)℃熱水處理2～3 h，再用80％敵敵畏和50％多菌靈可濕性粉劑1：800液浸種5～10 min，然后分別種植在塑料桶內(nèi)，置于防蟲溫室，常規(guī)栽培管理。

1．2接種病毒源及接種液準(zhǔn)備

病毒源取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所李文風(fēng)等從甘蔗上分離鑒定的高粱花葉病毒強(qiáng)致病性分離物SrMV～HH1(另文發(fā)表)，繁殖保存在甘蔗品種云蔗89-151上。

接種前取幼嫩的病葉組織剪細(xì)后，加3倍量(V／W)濃度為0.1 mol／L，pH為7.2的磷酸緩沖液(含0.2％Na₂SO₄)，研磨成勻漿，雙層紗布過濾，濾液即為病毒接種液。

1．3鑒定方法

1．3．1手指摩擦接種法

選擇甘蔗苗期陰涼的傍晚進(jìn)行接種。撒適量500～600目金剛砂于病毒接種液中，攪拌混勻，以拇指和食指尖沾濕接種液，緊捏供試甘蔗小苗基部，加壓輕輕搓揉至擦傷蔗葉表皮，重復(fù)接種3次，每次間隔7 d，每個品種接種20株。

發(fā)病率調(diào)查方法：首次接種7 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔15天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄接種日期、接種苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[6]的標(biāo)準(zhǔn)按1～5級分級進(jìn)行抗性水平分類(表1)。

1．3．2切莖接種法

甘蔗生長期進(jìn)行。用鋒利刀片或枝剪把甘蔗植株地上部分沿土表快速切去，再用滴管吸1滴病毒接種液滴入留下的地下蔗頭創(chuàng)面上，每品種接種20株，之后用報紙蓋住遮光24 h后揭開。

發(fā)病率調(diào)查方法：接種20 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔15天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄接種日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級標(biāo)準(zhǔn)：同1．3．1。

1．3．3田間自然感病法

選擇本所甘蔗花葉病易于發(fā)生和傳播的田塊設(shè)置自然感病試驗(yàn)觀察田。上述11個供試品種，每品種種植2行，行長5 m，為1小區(qū)。小區(qū)間種植1行病蔗(云蔗89-151)，作為病原，各小區(qū)隨機(jī)排列，重復(fù)3次。

發(fā)病率調(diào)查方法：種植50 d后，開始調(diào)查發(fā)病率，以后每隔30天調(diào)查1次，直至發(fā)病率穩(wěn)定為止。調(diào)查記錄種植日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病叢數(shù)。

分級標(biāo)準(zhǔn)：同1．3．1。

2結(jié)果與分析

2．1兩種接種方法接種效果比較

通過比較兩種接種方法甘蔗花葉病的接種效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)：11個供試材料中，除Co281兩種接種方法都未致其發(fā)病外，其余10個材料甘蔗生長期切莖接種法發(fā)病率均比手指摩擦法高，且發(fā)病顯著、發(fā)病均勻。以其發(fā)病株率作百分?jǐn)?shù)顯著性t測驗(yàn)，p＜0.01，表明切莖接種法的發(fā)病率極顯著地高于手指摩擦接種法。

2．2切莖接種法與田間自然感病法對SrMV-HH1抗性鑒定結(jié)果比較

比較11個甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田問自然感病法對SrMV-HH1的抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)：兩種方法發(fā)病率呈正相關(guān)，且相關(guān)程度極密切，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 7；根據(jù)1．3．1的分級標(biāo)準(zhǔn)，11個材料兩種方法鑒定所得的抗病性和抗病等級結(jié)果完全一致，說明切莖接種法鑒定結(jié)果能真實(shí)反映甘蔗品種材料的自然抗感性，因而可以替代田間自然感病法鑒定。

3小結(jié)與討論

甘蔗抗花葉病鑒定是甘蔗抗病育種的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而室內(nèi)人工接種鑒定甘蔗對花葉病的抗性是抗花葉病鑒定的一個重要組成部分，具有快速和鑒定材料數(shù)量不受限制，環(huán)境條件可人為控制，可以滿足大規(guī)模篩選抗源材料的優(yōu)點(diǎn)。室內(nèi)人工接種鑒定可大批量篩選抗源、使育種工作者及時了解掌握育種材料的抗感性，從而合理選配親本組合、選育出抗病優(yōu)良品種供生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。由于目前常用的兩種室內(nèi)人工接種方法(噴霧接種法、手指摩擦接種法)都需要在接種前用手工搓揉蔗葉制造傷口，因不易掌握搓揉力度，往往導(dǎo)致搓揉傷口不均勻，從而使接種后花葉病發(fā)病不均勻，致病性不穩(wěn)定，影響鑒定結(jié)果；此外，甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難。

本研究研制出的甘蔗仡葉病接種新技術(shù)－甘蔗生長期切莖接種法，通過和常用的接種技術(shù)比較，具有以下特點(diǎn)：(1)接種后甘蔗花葉病發(fā)病顯著、靈敏度高，可以有效區(qū)分不同甘蔗品種(寄主)之間對病害的抗感性；(2)運(yùn)用切莖后在切口處點(diǎn)病毒液的接種方法，制造的傷口均勻，接種病毒量一致、接種后發(fā)病均勻、結(jié)果穩(wěn)定性好；(3)由于帶毒收砍工具(蔗刀等)交叉感染是甘蔗花葉病傳播的主要途徑，而生長期切莖接種法與此種傳播方式很相似，因此鑒定結(jié)果更接近于田間自然感病結(jié)果；(4)生長期切莖接種法快速簡便，不用人工搓揉甘蔗葉片，不易劃傷手，因而可操作性強(qiáng)、接種工效高。因此可以對大批量材料進(jìn)行鑒定和篩選，為育種和生產(chǎn)部門提供更多更廣泛的抗源材料。