土壤中有益放線菌的高效分離、篩選和生物測定技術

黃世文　高成偉　王　玲　王全永

摘要：結合他人經驗和近年作者的實際工作，本文系統介紹了土壤標本的采集、處理，放線菌的分離、純化。放線菌分離物及其代謝產物對病原菌(真菌、細菌)、害蟲和雜草的生物測定、評價，為研發微生物農藥打下基礎。

關鍵詞：土壤標本；放線菌；分離；生物測定

中圖分類號：Q 939．132

放線菌是產生抗生素活性物質最大的、具有很大經濟價值的一類原核微生物。迄今，在工業、醫學和農業上都有許多利用抗生素的成功實例。我國自20世紀50年代就開始研究利用抗生素，在農業上主要是防治各種作物的病蟲害，如5406防治土傳病害，推廣面積曾達667萬hm²以上；井岡霉素防治水稻、麥類紋枯病、菌核病等，每年應用面積1 333萬hm²以上，自投放市場以來已30多年，一直對紋枯病高效，未發現抗藥性。阿維菌素自20世紀90年代投放國內市場以來，已逐步成為繼Bt制劑、井岡霉素之后生物農藥產業的支柱產品，為我國生物農藥市場贏得了巨大商機。國內至今已完成登記阿維菌素產品80多個，是明確最具發展潛力的生物農藥之一。放線菌及其產生的抗生素的研究、開發與應用取得了巨大的社會、經濟和生態效益。

放線菌大量存在于土壤中，從土壤中分離、純化、快速篩選目標放線菌是抗生素開發、應用的基礎。下面結合他人經驗和作者近年的實際工作，從土壤采集、處理、菌株分離、純化，放線菌及其代謝產物對病原菌、害蟲、雜草等的生物測定等方面作一介紹。

1放線菌的分離

1．1土壤標本的采集

放線菌屬好氣性微生物，主要生活在較干燥、透氣性好、中性到微堿性、有機質豐富的土壤中，特別是在我國南方熱帶及亞熱帶地區肥沃的土壤中，防線菌種類豐富。采集土壤標樣時，應根據放線菌的生活特性，有針對性地進行采樣。宜選擇菜地、茶園、果園等地采樣。選定采樣地點后，先鏟去表層土，挖取5～30 cm深的土壤數十克，裝入牛皮紙信封，封好袋口；潮濕的土壤宜裝入塑料袋或鋁盒內，做好編號記錄，帶回實驗室供分離用。

采回的土壤標本一般宜及時進行分離，如不能做到隨采隨分，宜將土壤放在陰涼、通風干燥處，使其風干，保藏備用，但保藏時間不宜過長。

放線菌的分離方法很多，這里主要介紹分離普通放線菌的彈土法和稀釋畫線法。

1．2放線菌的彈土分離法

1．2．1分離培養基

分離放線菌常用的培養基主要有：

a．高氏1號培養基：可溶性淀粉2.0％、K₂HPO₄0.05％、NaCl 0.05％、KNO₃0.1％、MgSO₄·7HO₂0.05％、FeSO₄0.001％、瓊脂1.5％～2.0％、pH 7.2～7.4、在121℃(15磅)高溫高壓滅菌20 min。

b．葡萄糖——天門冬素瓊脂培養基：葡萄糖1.0％、天門冬素0.05％、牛肉膏0.2％、K₂HPP₄0.05％、瓊脂2.0％、pH6.8或自然、8磅滅菌30 min。

c．精氨酸一甘油瓊脂培養基：精氨酸0.1％、甘油1.25％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂0 0.05％、NaCl0.1％、ZnSO₄·7H₂O0.000 1％、CuSO₄·5H₂O0.000 1％、Fe₂(SO₄)₃·6H₂O0.001％、MnSO₄·H₂O0.000 1％、瓊脂2.0％，pH 9.0，8磅滅菌30 min。

1．2．2平板培養基制備

根據分離量多少，準備好消毒高氏一號培養基500 mL或1 000 mL，滅菌的7 cm或9 cm直徑培養皿中倒入10～20 mL培養基，制成平板備用。

1．2．3土壤準備與接種

將土壤用研缽研細，60目過篩，取一定量細土平鋪于滅過菌的光滑硬紙板上，紙面積略大于培養皿的口徑，將多余的土輕輕傾去，見紙板上有一層細土粒粘附著則較為理想。接種時將倒好培養基的皿蓋微微揭開，將土壤紙板粘土面向下輕輕插入覆蓋其上，用皿蓋微微觸動一下紙板并立刻抽出，蓋好皿蓋即接種完畢。取下的土壤紙板，還可用于第2、第3及第4套分離培養皿接種。用于第2套接種時，輕輕彈動一下紙板；用于第3、第4套皿接種時，可在紙板背面稍加重彈力，使粘附于紙板上殘留的少量土粒落下，達到控制理想的出菌率。

如果要分離罕見的放線菌，如小單孢菌、小雙孢菌．游動放線菌或嗜熱放線菌等，則可將土壤研細后作干熱處理(120℃下處理1 h)。這樣在分離時可以大大降低細菌、霉菌和鏈霉菌的數量，使罕見的放線菌出現的比率提高。

1．3稀釋分離法

此法的準備工作與彈土法相同，但稀釋比應根據土壤中放線菌數量的多寡來決定。因此，往往在正式分離前需做一次預備分離試驗，找出適當的稀釋比。通過預備分離試驗，可以觀察到不同的土壤中放線菌、細菌和霉菌的數量關系，啟示在分離工作中應采取何種對策。若土壤中細菌和霉菌過多時，可考慮在分離培養基中加入相應的抑菌劑。如抑制霉菌可加制霉菌素(50單位／mL)或多菌靈(30單位／mL)抑制細菌可加鏈霉素(25～50單位／mL)等。

稱取研細的土壤5 g，加入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，充分振蕩，制成10^-1土壤濃度懸浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0 mL上清液，移入盛有9 mL滅菌水的試管中，制成10^-2土壤濃度懸浮液。依此類推，制成10^-3、10^-4和10^-5土壤濃度懸浮液，從土壤中分離放線菌多采用10^-3～10^-5土壤濃度。通常吸取上述3種濃度懸浮液0.1 mL(約2滴)，加到分離培養基平板上，用滅菌涂布棒涂均。

1．4放線菌培養、挑菌和純化

將上述接種好的培養皿倒置于28℃恒溫培養箱中培養。若分離嗜熱放線菌，則應放在45～50℃下培養。3～4 d后即可長出放線菌單菌落。

在分離放線菌之前，必須學習、了解放線菌的形態特征、顏色等。初次分離，如果沒有固定目標菌類，應將所有的放線菌單菌落都及時轉接到高氏一號瓊脂或葡萄糖一天門冬素瓊脂斜面上，進行純化

培養。一般鏈霉菌的菌落大，氣生菌絲豐茂，色澤多種多樣；而小單孢菌、諾卡氏菌、游動放線菌等菌落小，光禿無氣生菌絲，色澤鮮艷。應注意選留后幾類放線菌，在教學上可豐富分類學實驗內容，同時也可為篩選新抗生素或酶制劑等提供菌源。

如果細菌、霉菌干擾不嚴重時，可延長分離平板的培養時間，讓一些生長速度慢的放線菌陸續地生長出來，分批挑菌。一般純化培養7～14 d，待生長成熟后終止培養，編號登記，備用。

2放線菌的生物測定

經純化培養的放線菌有否生產實用價值，即其代謝產物是否對有害生物(在農業上主要指病蟲草)有毒性，需要通過生物測定來確定。放線菌的生物測定，不同的對象測定方法不同，一般是用放線菌的發酵代謝產物進行測定。下面將從放線菌發酵培養、代謝產物的提取、對病原菌、害蟲和雜草的生物測定等方面作一介紹。

2．1放線菌的發酵培養基

(1)日本培養基：2.5％葡萄糖、1.0％大豆粉、0.4％KC1、0.25％酵母提取汁、0.1％牛肉膏、0.5％(NH₄)₂SO₄、0.02％K₂HPO₄、0.3％CaCO₃(消毒前pH調至7.2)。(2)中國農大培養基：2％淀粉、0.1％KNO₃、0.066％K₂HPO₄·7H₂O、0.05％Mg-SO₄·7H₂O、0.05％NaCl、0.001％FeSO₄、pH7.2。

2．2發酵培養及離心上清液的提取

250 mL三角瓶中每瓶裝100 mL發酵培養基，高溫高壓消毒20 min，冷卻備用。每瓶中接入培養7 d的放線菌菌塊(d=0.9 mm)2～4塊。在28～30℃恒溫搖床上以120～150 r／min振蕩發酵培養7 d，發酵液在離心機上以1 500 r／min離心10 min，取上清液裝入消毒瓶中，加少許防腐劑保存備測。沉淀物(菌絲團)裝另一消毒瓶，加等體積分析純丙酮浸提24 h，以同樣方法離心，取上清液，備測。

2．3放線菌發酵液對有害生物的生物測定

2．3．1發酵液對病原菌的毒性測定

2．3．1．1對真菌的生物測定

一般是將放線菌發酵上清液與被測菌的培養基混合，配成不同濃度的發酵液培養基，倒入直徑9 cm消毒培養皿，制成平板，同時以空白發酵培養基離心上清液和無菌水代替發酵上清液，與被測菌培養基混合作為對照。將生長一致的7 d菌齡被測菌菌塊(d=0.6～0.8 cm)接入平板中央；也可取0.1 mL放線菌發酵液培養基平板上，用消毒三角玻棒涂布均勻，直接將被測病原菌塊接入平板中央，有菌一面朝下。接種后置恒溫培養箱(溫度視不同的菌而定，一般多為28℃)培養，每隔1天按十字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落顏色、生長情況，菌核有無生成等，直到對照菌落長滿培養皿為止。

2．3．1．2對細菌的生物測定

細菌與真菌有所不同，一般是將被測細菌與該菌的培養基混合，充分搖勻，制成含細菌培養基平板。用0.7 cm直徑的打孔器將定性濾紙打孔，圓紙片消毒后備用。將放線菌發酵離心上清液配成不同濃度，同樣以空白發酵培養基離心上清液和無菌水為對照。圓紙片蘸發酵離心上清液或對照液，紙片充分浸濕，放入時不滴液為宜，放人含細菌培養基平板中央。置恒溫培養箱中培養，培養箱中宜保持較高的濕度(RH＞85％)，以免“藥紙片”很快干燥，影響藥效。每隔1天按十字交叉法測量1次抑菌直徑，并觀察抑菌圈的清晰度，一般至少測量5次。

最后通過計算真菌菌落大小和對細菌的抑菌圈大小來評價放線菌發酵代謝產物對病原菌的毒性。真菌菌落越小，細菌抑菌圈越大，說明放線菌發酵代謝產物毒性強，反之則相反。

一般的，由于對分離到的放線菌到底哪種類型菌對病原菌有效，哪種菌無效，心中無底，而且初分離到的菌種數量較多。為減少發酵、離心等的工作量和費用，對初次分離到的菌株最好采用對峙培養法進行初步測定。只有那些經初步測定，對病原菌具有較強抑制活性的菌株才進行發酵培養、離心提取上清液作測定。當然有些放線菌可能對峙培養效果好，而發酵培養產毒差，有些菌則相反，造成誤選或淘汰一些有潛力的菌株。

2．3．2發酵液對害蟲毒性的測定

放線菌發酵液對害蟲的毒性測定可分為觸殺和胃毒作用進行。

2．3．2．1胃毒作用測定

方法1：將發酵液配成不同濃度藥液，將供試害蟲喜食的寄主植物葉或莖在藥液中浸30～60 s(視植物類型而定，表面蠟質多的植物浸的時間要長些)，使表面濡濕，懸掛晾干不滴液，置入大培養皿或大試管，放入供試蟲，每皿5～10頭(條)(視蟲量和培養皿及試管大小而定)，蓋上皿蓋或一層紗市封口。每處理重復3次，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數。

方法2：對于蠶、菜青蟲或小菜蛾等食葉昆蟲的測定，可采用以下方法：將2片供試蟲寄主植物葉片正面涂藥，將涂藥葉面相對疊合，并用大頭針嚴密訂緊，將葉邊緣修剪整齊，以免蟲子接觸藥液，使蟲子只能通過取食才能接觸藥液，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數。

2．3．2．2觸殺作用測定

方法1：將供試蟲不取食的作物葉片正面、或塑料片用不同濃度的發酵液涂布，待藥液干后，將供試蟲放在上面，讓其爬行，但不取食，幾分鐘后移入寄主葉片上，讓其取食，正常飼養，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數。

方法2：供試蟲飼養在寄主植物上，用喉頭噴霧器將不同濃度的發酵液直接噴霧在試蟲體表，每隔一定時間觀察、描述試蟲的活動、取食情況，記錄死蟲數。上述試驗均需設空白發酵培養基離心上清液和無菌水作對照，如能增設一個供試蟲常用防治藥劑作對照則更好。

2．3．3發酵液對雜草毒性的測定

將待測雜草種子用溫水預浸24～48 h(視不同雜草種而定)備用。將放線菌發酵離心上清液配成不同稀釋濃度，設空白發酵培養基離心上清液和無菌水為對照。

2．3．3．1測定發酵液對雜草種子發芽率的影響

挑10粒飽滿一致、預浸過的雜草種子放入不同濃度發酵離心液中浸24 h，撈出后分別置于用相同發酵液濃度浸過的吸水紙或濾紙上，放人培養皿，蓋上蓋，在30～35℃下催芽，每隔1天記錄種子的發芽情況，觀察芽的生長狀況，并作描述。觀察3～4次(6～8 d)，每處理最少重復3次，最終統計發芽率。

2．3．3．2測定發酵液對雜蘋根、芽生長的影響

將預浸過的雜草種子在30～35℃下催芽至露白，挑10粒芽長及生長基本一致的種子放入不同濃度發酵離心液中，在30℃恒溫下培養，分別在3 d和6 d天測量雜草根、芽長，同時觀察根、芽生長情況，如生長是否健壯，有無須根，顏色是否正常，并作描述。

所獲數據進行統計分析后，即可初步判斷某一放線菌是否具有開發、應用價值，是否值得進一步研究。