植物基因組ＤＮＡ提取

摘要 介紹在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中分別采用SDS法和CTAB法對(duì)辣椒基因DNA進(jìn)行提取的過(guò)程，結(jié)果表明，改進(jìn)的CTAB法提取的DNA含量較高且純度較好；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在電泳檢測(cè)過(guò)程中，恒定電流檢測(cè)圖像結(jié)果中呈現(xiàn)的基因組DNA條帶要比恒定電壓檢測(cè)結(jié)果平整。

關(guān)鍵詞 辣椒；DNA；電泳

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-489X（2008）20-0127-02

DNA提取是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的第一步，也是大學(xué)生必須掌握的專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)技能。現(xiàn)有的植物DNA提取方法很多，在教學(xué)過(guò)程中可根據(jù)材料本身特點(diǎn)的不同而選擇不同的方法。目前使用較多的是SDS（十二烷基硫酸鈉）法、CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[1]，主要用于草本植物和不含酚類(lèi)或含酚類(lèi)較少的植物DNA提取。在辣椒基因組DNA提取過(guò)程中，由于葉片中富含的酚類(lèi)物質(zhì)可使DNA降解，也可與DNA結(jié)合形成沉淀物，嚴(yán)重影響DNA的提取效果[2-3]。本文以教學(xué)實(shí)驗(yàn)植物基因組DNA提取中SDS方法[4]為基礎(chǔ)，然后利用改進(jìn)的CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法提取辣椒基因組DNA與之進(jìn)行比較，摸索適合辣椒基因組DNA提取的方法，以便更好地服務(wù)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料以常規(guī)辣椒品種保加利亞尖椒幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，采集新鮮葉片數(shù)片洗凈后再用去離子水清洗2次，晾干，置于4 ℃冰箱冷藏室內(nèi)備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1）SDS（十二烷基硫酸鈉）法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。

2）CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[5]。

①稱(chēng)取干燥新鮮葉片約0.4 g置于干凈的研缽中，剪成小片，加液氮充分研磨約8 min，至粉末呈淺灰綠色即可。

②將磨碎的粉末等量分裝于4個(gè)1.5 mL的微量離心管中，各加1 mL預(yù)熱（約50 ℃）的2×CTAB緩沖液[含2% CTAB（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，Sigma），1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0.2%β-巰基乙醇（V/M）]，充分搖勻。

③60 ℃保溫1.5 h，每隔15 min～20 min搖勻一次。然后室溫放置30 min，其間搖動(dòng)1～2次。

④10 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-異戊醇至滿(mǎn)管，并用力搖勻。

⑤10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-異戊醇至滿(mǎn)管，并用力搖勻。

⑥10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液。先加1/10體積預(yù)冷（4 ℃）的3 mol/L NaAc，再加預(yù)冷（4 ℃）的異丙醇至新管，將離心管輕輕翻轉(zhuǎn)幾次（約5 s），-20 ℃放置2 h以上或過(guò)夜。

⑦10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗脫2次，再用無(wú)水乙醇洗脫一次。晾干（或用滅菌過(guò)的濾紙吸干）后，加50 μL 1×TE溶液溶解。

⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA，30 ℃水浴或室溫1 h去除RNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳檢測(cè)在恒定電壓（80 V）或恒定電流（80 mA）的條件下，取5 μL DNA加2 μL上樣緩沖液，于1%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/μL EB）中電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)保存圖像，通過(guò)帶形分析來(lái)比較DNA的完整性等質(zhì)量特點(diǎn)。

2 結(jié)果分析

如圖所示，經(jīng)SDS法、CTAB法提取辣椒基因組DNA均獲得成功（圖1、圖2），但通過(guò)帶形分析，等量DNA經(jīng)電泳檢測(cè)后亮度呈現(xiàn)不同，表明這兩種方法提取的DNA總量有較大差別。由圖2可知，CTAB法提取的DNA含量較高且純度較好，能直接用于PCR、RAPD和RFLP等分子實(shí)驗(yàn)。

此外，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，恒定電流條件下DNA條帶比恒定電壓電泳結(jié)果平整，表明在此實(shí)驗(yàn)中恒定電流更適合于電泳檢測(cè)。

3 討論

DNA提取方法主要是采用破壁和破膜的方法，SDS、CTAB等去污劑均能夠破壞細(xì)胞膜使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，從而釋放DNA；同時(shí)在一定的鹽濃度下，它們也可以沉淀色素和多糖。本研究表明，在富含酚類(lèi)物質(zhì)的辣椒葉片DNA提取過(guò)程中，改進(jìn)的CTAB法提取的DNA含量較高且純度較好，比SDS法好。所以在以后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，一般應(yīng)采用CTAB法，因?yàn)镃TAB法不僅簡(jiǎn)便、快速，而且DNA產(chǎn)量高，適用于一般分子生物學(xué)操作。

在電泳過(guò)程中，將電泳儀調(diào)至水平，然后在恒定電壓條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，多次DNA條帶電泳結(jié)果均呈現(xiàn)一定程度的不平整現(xiàn)象。在采用CTAB法提取DNA后，采用恒定電流的條件進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果大有改觀(guān)。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是在電泳過(guò)程中電泳液和凝膠溫度不斷升高，導(dǎo)致電阻變化，從而引起電流不穩(wěn)定造成的。

通過(guò)研究表明，用改進(jìn)的CTAB法提取植物基因組DNA，在恒流電泳的條件下DNA電泳檢測(cè)更有利于植物基因組DNA提取的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，可以進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)中推廣使用。

參考文獻(xiàn)

[1]王關(guān)林，等.植物基因工程原理與技術(shù)[M].第二版.北京:科學(xué)出版社，2002，742-749

[2]Proberki S L， Bailey G， Baum R B. Modification of a CTAB extraction protocol for plant containinghigh polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Mol Rep，1997(12):8-15

[3]王巖，等.辣椒葉片DNA提取方法的優(yōu)化[J].長(zhǎng)江蔬菜，2006，8:59-61

[4]魏群，等.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社，1999，69-70

[5]李建武，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京:北京大學(xué)出版社，2001，264-265