燈盞花素注射液對實驗性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護作用

　　摘　要：目的：探討燈盞花素注射液對實驗性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal isehemia－reperfusion，RIR)后的視神經(jīng)保護作用及其可能的作用機理。方法：實驗分組及給藥：將健康新西蘭兔54只隨機分為正常對照組(18只)，生理鹽水對照組(18只)，燈盞花素注射液組(18只)，采用前房穿刺加壓灌注使生理鹽水對照組和燈盞花素注射液組眼內(nèi)壓升高至14.6kpa(110mmHg)，維持60min，制作兔實驗性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIR)模型。造模后立即每日1次按體重分別以耳緣靜脈注入燈盞花素注射液，生理鹽水對照組同一時間以耳緣靜脈給予等量生理鹽水，正常對照組不予給藥。分別于再灌注1d，3d，7d分別處死每組動物的6只兔子，光學顯微鏡下和電鏡下觀察第3d的組織學變化和超微結構，觀察各組視網(wǎng)膜電圖(ERG)b波振幅，免疫組織化學法測定各組視神經(jīng)一氧化氮合酶(iNOS)的表達。結果：再灌注1d開始生理鹽水對照組ERG的b波振幅緩慢升高，病理組織損害逐漸加重，視網(wǎng)膜中iNOS陽性表達增多，第3天達高峰，第7d開始下降，與正常對照組相比有顯著差異(P＜0.01)。與生理鹽水對照組相比，燈盞花素治療組電鏡下病理組織損害減輕，ERG的b波振幅明顯恢復(P＜0.01)，iNOS陽性神經(jīng)元明顯減少(P＜0.01)，第7d時燈盞花素治療組與正常對照組的ERG的b波和iNOS陽性神經(jīng)元差異無顯著意義(P＞0.05)。結論：燈盞花素注射液可以減輕視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷對組織造成的損害，其機理是燈盞花素注射液可以減少細胞內(nèi)Ca²⁺超載，清除自由基和增強抗氧化能力，從而對實驗性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有一定的保護作用。
　　關鍵詞：燈盞花素；視網(wǎng)膜缺血再灌注；iNOS
　　中圖分類號：R285．5　文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349(2008)01-0030-04
　　
　　視網(wǎng)膜缺血再灌注(Retinal isoeheimal reperfusion，RIR)損傷是眼科常見的一種病理過程。見于青光眼、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、缺血性視神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種眼病，造成視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的損傷，嚴重損害視功能。因此，探討視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷機制，尋找新的有效而又沒有明顯副作用的藥物來防治視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，已成為全世界眼科專家及眾多學者的研究課題。
　　
　　雖然氧自由基在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷發(fā)揮的重要已明確，但大部分抗氧自由基藥物仍處于臨床前期。燈盞花素又名燈盞細辛，自20世紀70年代開始應用于臨床多種疾病的治療，安全可靠，并具有抗氧自由基、保護視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的功能。本實驗旨在通過建立兔視網(wǎng)膜缺血再灌注的動物模型，觀察不同劑量燈盞花素注射液對損傷的視網(wǎng)膜在自由基代謝方面的影響，為臨床尋找安全、有效治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的藥物提供理論依據(jù)。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　動物及分組　健康新西蘭兔54只，由昆明醫(yī)學院動物中心提供，體重2.0～2.5kg，雌雄不限，隨機分組后編號，分籠喂養(yǎng)，試驗前裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查雙眼角膜透明，瞳孔等大等圓，虹膜血管清晰，眼底無異常無異常。54只隨機分為正常組，燈盞花素注射液組和生理鹽水對照組各18只。每組再隨機地分為再灌注后1、3、7d組，每組6只新西蘭兔，每組右眼為實驗組眼，左眼不予處理。
　　1．2　主要藥物、儀器與設備　燈盞花素注射液(云南龍津藥業(yè)有限公司)，直接檢眼鏡(蘇州醫(yī)療器械廠)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)，多聚賴氨酸，兔抗大鼠NOS-2多克隆抗體及即用性sp免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)，DAB顯色試劑(福建新邁公司)，H-600電子顯微鏡(日本日立公司)，視網(wǎng)膜電生理儀(意大利安倍公司)。
　　
　　1．3　動物模型的建立 正常對照組不造模。生理鹽水對照組和燈盞花素注射液治療組均制造兔視網(wǎng)膜缺血損傷的模型，具體方法是新西蘭兔經(jīng)耳緣靜脈注入3％戊巴比妥鈉(100mg／kg)全麻后，眼局部滴用愛爾卡因眼液，1％安爾碘消毒兔眼周皮膚，氯毒素眼液消毒眼球，復方托品酰胺散瞳，將連接無菌生理鹽水輸液管的7號小兒頭皮針沿顳側角鞏膜緣刺入前房，避免損傷虹膜及晶體，緩慢升高輸液瓶與實驗眼垂直距離150cm處，此高度在眼內(nèi)形成110mmHg(14.46ka)的眼壓。眼內(nèi)壓升高后，可見球結膜2min內(nèi)蒼白，由于眼底血管被阻斷，導致眼底反光由紅色變?yōu)榘咨瑫r虹膜也因缺血而變白，直接檢眼鏡觀察眼底，可見到眼底血管變細或呈念珠狀，維持60min緩慢降低鹽水瓶至動物水平，撥出針頭，可見眼結膜充血，視網(wǎng)膜血液重新再灌注。即視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的模型建立成功。如果在穿刺中不慎損傷晶狀體，則去掉該動物的數(shù)據(jù)，術后涂抗生素眼膏以防止角膜感染。
　　1．4　給藥方法　在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷藥物治療組按每kg體重2mg燈盞花素注射液經(jīng)生理鹽水稀釋后從耳緣靜脈給藥，生理鹽水對照組和正常對照組給等劑量生理鹽水，在1、3、7d處死各組兔子，每小組6只。
　　
　　2　觀察指標和測定方法
　　
　　2．1 電子顯微鏡標本的制作和觀察　再灌注3d，沿耳緣靜脈注射空氣40ml栓塞處死兔子，迅速摘除眼球，在冰環(huán)境中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去眼前節(jié)和晶狀體，外翻眼球，解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜、冰生理鹽水沖洗，浸入冷電鏡固定液(10％多聚甲醛100ml，25％戊二醛50ml，0.2MPB 250ml，蒸餾水100ml，調(diào)節(jié)PH至7.4，48h，1％餓酸后固定，脫水、丙酮包埋，同上述部位制成50nm超薄切片，透射電子顯微鏡觀察拍照。
　　2．2　視網(wǎng)膜電圖(ERG)的測定　新西蘭兔暗適應30min，新西蘭兔經(jīng)耳緣靜脈注入3％戊巴比妥鈉(100mg／kg)全麻后，眼局部滴用愛爾卡因眼液。0.5％復方脫毗卡胺散瞳，記錄電極即角膜接觸鏡電極置于角膜接觸鏡上，電極盡量與角膜最大面積接觸，參考電極置于兩眼連線中點皮下。操作時間白光閃耀，反應持續(xù)時間200ms，光強度10cd·s／m²，每個時間點至少測量3次，間歇期點生理鹽水，防止發(fā)生暴露性角膜炎，記錄b波振幅與處理前b波振幅比值。
　　
　　2．3 iNOS免疫組化染色　石蠟切片在55～60℃的溫度下烤2h。浸入7.5ml／L的HO液中20min，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶物酶。行正常山羊血清封閉以清除非特異性染色。滴加iNOS特異性抗體，測量方法和步驟按說明書進行，陽性結果以胞漿及胞盒內(nèi)出現(xiàn)棕黃色和黃色顆粒為準。每只眼球取兩張切片，用醫(yī)學圖象分析統(tǒng)計進行iNOS的吸光度。
　　2．4　統(tǒng)計學分析 實驗結果輸入計算機，運用統(tǒng)計軟件(SPSS 11.0)進行統(tǒng)計分析，計算組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。
　　
　　3　結果
　　
　　3．1　高眼壓后大鼠外眼變化情況 所有模型眼均有球結膜水腫、充血、角膜水腫、霧狀混濁。球結膜水腫、充血在2～4d后消失，角膜水腫均于次日消失。
　　3．2　ERGb波的測定 視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后隨著時間的延長，兔b波波幅持續(xù)緩慢升高。經(jīng)燈盞花素注射液治療后，兔b波波幅在各段時間點與生理鹽水對照組相比都有明顯提高(P＜0.01)，與正常組相比，第7天時，b波波幅在各段時間點無明顯差異(P＞0.05)，見表1。
　　3．3　投射電鏡觀察　再灌注3d正常組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)外核細胞層細胞胞核大，核仁清楚，核膜光滑，胞漿中可見線粒體等細胞器，而生理鹽水對照組，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞腫脹、退行性變。細胞膜部分溶解、核固縮，偏位，染色質分布不均。細胞質內(nèi)多數(shù)細胞器溶解，形成空白區(qū)。僅見的少量細胞器中，線粒體高度腫脹，空泡化、嵴大部分消失，外膜破裂。粗面內(nèi)質網(wǎng)脫顆粒，滑面內(nèi)質網(wǎng)擴張。燈盞花素注射液治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞輕度腫脹，細胞核完整，核內(nèi)染色質分布均勻。細胞質內(nèi)細胞器明顯較模型組增加，線粒體輕度腫脹。嵴可見。滑面內(nèi)質網(wǎng)、高爾基復合體稍腫脹，見圖1～3。
　　3．4 iNOS的免疫組化　正常視網(wǎng)膜內(nèi)核層和節(jié)細胞層有少量iNOS表達。再灌注1d。生理鹽水對照組iNOS的表達開始增高，3d時達高峰，7d后漸下降，與正常組相比，差異有顯著性意義(P＜0.01)。在各灌注時間點，燈盞花素治療組iNOS的吸光度與對照組相比明顯升高(P＜0.01)，與正常組相比無明顯差異(P＞0.05)，見表2。
　　
　　4　討論
　　
　　視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的機制非常復雜，目前認為細胞內(nèi)Ca²⁺超載、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，自由基的損傷、細胞因子的作用等多種因素參與了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的過程。其中自由基的連鎖反應和細胞內(nèi)CaZ+超載是造成組織損傷的中心環(huán)節(jié)。NO具有自由基的作用，結構簡單，極不穩(wěn)定，由一氧化氮和酶(NOS)催化L～精氨酸生成，對視網(wǎng)膜造成損傷。NO半衰期只有數(shù)秒鐘，因此，目前多用一氧化氮和酶(NOS)的表達來代表NO的水平。
　　NO是半衰期很短的自由基氣體，正常眼內(nèi)有少量NO存在，一方面作為神經(jīng)調(diào)質可以抵抗內(nèi)皮素的縮血管作用，另一方面很多研究表明NO在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷和NMD介導的神經(jīng)毒性中發(fā)揮著重要作用，NO能與超氧陰離子作用生成強氧化物，對組織有很強的氧化作用。引起能量缺乏，DNA損傷，合成抑制以及誘發(fā)程序性細胞死亡，破壞視網(wǎng)膜屏障。NO由一氧化氮和酶(NOS)催化L－精氨酸生成，一氧化氮和酶(NOS)分為3種類型，神經(jīng)元型(nNOS，NOS-1)，主要存在神經(jīng)細胞內(nèi)，內(nèi)皮型(eNOS，NOS-3)，主要存在血管內(nèi)皮，誘導型(iNOS，NOS-2)，主要存在星型細胞和膠質細胞內(nèi)。生理性一氧化氮和酶由nNOS和eNOS合成，又稱為結構型一氧化氮和酶，其活性依賴于鈣。在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中，nNOS和iNOS及其所產(chǎn)生的NO在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中起損傷作用。NO通過與超氧陰離子反應產(chǎn)生過氧化氮來促進氧化損傷。NO會引起能量缺乏，DNA損傷，合成抑制以及誘發(fā)程序性細胞死亡，破壞視網(wǎng)膜屏障。實驗證明，缺血前先眼內(nèi)注射NOS抑制劑L-NAME可以改善視網(wǎng)膜缺血損傷。本實驗中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血再灌注時導致了視網(wǎng)膜結構和功能的破壞，并伴隨著iNOS的升高，在對照組中，第1d iNOS開始升高，第3d iNOS達高峰，7d有所下降。說明iNOS參與了視網(wǎng)膜缺血損傷的過程。與生理鹽水對照組和正常對照組相比，燈盞花素注射液能減輕視網(wǎng)膜組織內(nèi)iNOS的生成，進一步保護了視網(wǎng)膜的結構和功能。
　　本實驗不僅觀察了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷時燈盞花素注射液能減少iNOS的生成，兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護作用，還從行態(tài)學上證實了燈盞花素能明顯減輕缺血再灌注后視網(wǎng)膜的中期內(nèi)層水腫，對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有較好的保護作用。在實驗中各個再灌注時間點，燈盞花素治療組的ERGb波振幅顯著高于生理鹽水對照組，說明燈盞花素注射液對視網(wǎng)膜缺血一再灌注損傷具有較好保護作用，且隨著時間的延長，保護作用增強。
　　近年來燈盞花素已經(jīng)被廣泛運用于臨床來治療血管性疾病，許多研究證明燈盞花素具有視神經(jīng)保護作用。燈盞花素可以改善視網(wǎng)膜、視神經(jīng)微循環(huán)，及提高大鼠高眼壓狀態(tài)下造成的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞細胞色素氧化酶活性。賈莉君等發(fā)現(xiàn)燈盞細辛具有提高和改善急性高眼壓后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的活性及活性節(jié)細胞密度的作用。有實驗證明燈盞細辛其具有抗氧化，清除自由基等功能，可通過抑制NO途徑對HO誘導的神經(jīng)損傷起到保護作用。近年來燈盞花素注射液被大量用于治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和缺血性視神經(jīng)病變等缺血性視網(wǎng)膜疾病，而且已被證實有確切的治療效果。筆者的實驗結果也證實了倍他洛爾保護缺血一再灌注損傷后的視網(wǎng)膜。
　　燈盞花素，又叫燈盞細辛，是以燈盞花乙素為主含少量燈盞花甲素的黃酮類混合物，是從菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬[E-rigeron briviscapine(Vant)HanolMass]全草(俗稱燈盞花)中經(jīng)提取、分離、精制而來。燈盞花制劑自20世紀70年代開始應用于臨床，目前已有片劑、膠囊、注射劑等多種劑型，己廣泛運用于臨床治療多種疾病，具有抗血栓和改善血液流變學等作用。在中醫(yī)學上具有活血化瘀，通經(jīng)活絡的功效。
　　燈盞花素對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護機制與其結構密切相關，燈盞花素是黃酮類化合物，清除活性氧的活性基團是酚羥基，酚羥基提供氫原子，與活性氧發(fā)生還原反應而發(fā)揮作用，燈盞花素本身具有的鄰二酚羥基結構能穩(wěn)定其與活性氧反應所形成的自由基[Hong Liu]。燈盞花素能以電壓依賴的方式阻斷細胞膜上的Ca²⁺通道，減少Ca²⁺內(nèi)流，降低細胞內(nèi)鈣離子濃度。并直接刺激細胞內(nèi)ATP依賴性鈣泵，使紊亂的細胞內(nèi)外鈣交換趨于正常，減輕鈣超載，從而打斷了鈣離子、氧自由基、興奮性氨基酸毒性之間的惡性循環(huán)，減輕了細胞變性和死亡。燈盞花素能阻止血管平滑肌細胞上L-型鈣通道，緩解缺血后視網(wǎng)膜血管痙攣，改善視網(wǎng)膜和視乳頭局部血液的供應，保護了內(nèi)層視網(wǎng)膜組織。
　　通過實驗證實，燈盞花素對視網(wǎng)膜確血再灌注損傷有保護作用，且呈明顯的量效關系，燈盞花素在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中可能不僅是通過抗氧自由基及抑制細胞內(nèi)鈣內(nèi)流而發(fā)揮作用，其作用機制有待進一步研究。通過對燈盞花素對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷保護機制的研究，不僅能為燈盞花素應用于眼科提供事實及理論依據(jù)，也為進一步探討視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的機制及燈盞花素作用機制提供了一條新途