成年大鼠海馬神經元培養衰老細胞的鑒定

摘 要：目的：鑒定不同年齡大鼠培養海馬神經元的衰老細胞鑒定。方法：取6月齡和18月齡雄性SD大鼠海馬進行原代海馬神經元培養，分別在培養6d、10d和14d利用衰老相關的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）進行細胞化學染色。結果：18月齡培養10d和14d的海馬神經元 SA-β-GAL染色較6月齡培養6d的海馬神經元明顯增多(p＜0.001)。結論：老年大鼠海馬神經元體外培養進入衰老狀態的時間較青年大鼠早。

關鍵詞：海馬神經元；衰老；衰老相關的β半乳糖苷酶

中圖分類號：R339.3文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）07-009-02

衰老相關的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）是目前被廣泛采用的一種生物學標記物，它在衰老細胞中表達升高，因此成為鑒定細胞衰老的一個標志［1，2］。值得提出的是，有些衰老的生物學標記并不具有普遍性，SA-β-GAL作為一個衰老的生物學標記在體外檢測復制衰老的細胞已經得到了廣泛的認可［3］，但其是否能夠用于檢測衰老神經元，目前尚未得到證實，因此在應用上應加以驗證。目前對衰老細胞的研究，衰老細胞從形態學上表現為細胞變大，變扁平［4］，然而在除此以外還有端粒變短，細胞周期停滯等特征，而鑒于神經元屬于靜止細胞，因此在衰老細胞鑒定生物學標記的選擇時具有特異性，本研究擬對培養不同天數的海馬神經元進行SA-β-GAL染色，從而鑒定衰老的海馬神經元，同時驗證SA-β-GAL在海馬神經元應用的可靠性。

1 材料與方法

1.1 海馬神經元原代培養

分別取6月齡及18月齡雄性SD大鼠各2~3只，進行海馬神經元原代培養。取海馬組織：全身75%酒精消毒，斷頭取腦，將整個腦組織置于冷的HBSS(無Ca2+Mg2+)平衡液中，利用彎頭玻璃棒將兩側海馬完整取出。HBSS液洗4次，去除混雜的血管和血液。胰酶消化：用剪刀將海馬組織剪成1mm3的小塊，用HBSS洗4次，0.25%的胰酶37℃消化15min。終止消化：加入終濃度為10%的胎牛血清孵育5min終止消化，隨后用HBSS洗4~5次去除殘留的胎牛血清。吹打細胞：在15mL離心管中加入5mL Neurobasal A用Pasteur管吹打組織碎塊，將渾濁的上清液收集到另一個15mL離心管中，200g離心10min，棄上清。接種細胞：沉淀用Neurobasal A液加B27重懸，在24孔板中接種在100mg/mL poly-L-lysine處理過的蓋玻片上，密度約5~8×105cells/mL，在37℃，5%CO2培養箱中培養。在培養第五天加入10mmoL阿糖胞苷抑制膠質細胞和纖維母細胞生長，從接種第六天起可進行實驗。

1.2 SA-β-GAL的細胞化學檢測

分別取細胞接種后第6d、10d和14d的培養神經元在4%的多聚甲醛中室溫固定15min，-20℃保存。接種細胞的蓋玻片在室溫下放置約30min，用X-Gal洗液（100mM磷酸鈉；2mM MgCl2；0.01%脫氧膽酸鈉）洗三次，每次15min，用X-Gal染液（100mM磷酸鈉，2mM MgCl2，150mM氯化鈉，0.01%脫氧膽酸鈉，0.02% NP-40，5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，1mg/mL X-gal）在37℃避光16~18h，PBS清洗3次，0.1%核固紅室溫復染20min。晾干后中性樹膠封片，光鏡下觀察，拍片，計數。

2 結果

SA-β-GAL陽性率均隨著培養時間延長而增加，在培養6d的神經元SA-β-GAL陽性表達較少，而在10d和14d的神經元中表達明顯增加(p＜0.001)，同時培養10d的18月齡組比6月齡組陽性率明顯增加（p＜0.05），然而在培養14d時兩組陽性率差別不明顯，表1所示。

3 討論

本研究結果提示，隨著培養時間的延長，成年海馬神經元中的衰老神經元明顯增加，與新生大鼠海馬神經元培養相比，成年大鼠神經元存活時間較短，出現SA-β-GAL陽性染色的時間較早（未發表）。在本研究中發現老年大鼠在海馬神經元的體外培養中，出現SA-β-GAL標記的衰老細胞較青年大鼠早，然而在延長培養后期，衰老細胞已趨向于飽和，而此時差別并不明顯。SA-β-GAL是目前比較普遍應用的衰老生物學標記物［1］，多數的研究應用于復制衰老，而復制衰老是指真核細胞在完成有限分裂次數后，喪失合成DNA的能力，導致增殖能力喪失而僅維持細胞基本的代謝能力的狀態，比較經典的復制衰老的細胞模型是人二倍體細胞（human diploid fibroblasts，HDFs）［2，5］。然而，神經元屬于靜止細胞，在體外培養中不再增殖和分裂，并且在體外研究中建立穩定可靠的衰老神經元的模型是研究中樞神經系統衰老的基礎，SA-β-GAL在成年大鼠神經元培養中的成功應用，不僅使細胞培養的來源更加廣泛，并且縮短了研究周期。除SA-β-GAL標記外，衰老的細胞還具有細胞變大，變扁平的形態學特點，然而在本研究中，延長培養的神經元形態學改變不明顯，因此SA-β-GAL是一個比較敏感的生物學指標，在以往的研究中，我們分別在不同年齡大鼠的大腦皮層和海馬區應用了SA-β-GAL標記了衰老神經元［6，7］，本結果利用體外培養的方式進一步驗證了結果的可靠性。

參考文獻：

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（責任編輯：陳涌濤）

Identification of Senescent Cultured Hippocampal Neurons from Adult Rats

Geng Yiqun1，2，Fu Yucai2，Xu Xiaohu2

(1. Shantou University/Hong Kong Chinese University Joint Shantou International Eye Center，Guangdong Shantou 515041，China

2. Shantou University Medical College，Guangdong Shantou 515041，China)

Abstract： Objective：To identify senescent hippocampal neurons in cultured cells from different age of rats. Method： Standard hippocmapal neurons culture was performed from 6-month and 18-month SD male rats. Senescence associated β-galactosidase (SA-β-GAL) staining was applied to 6th，10th and 14th day of culture. Results：SA-β-GAL staining of neurons of 10th and 14th day of culture from 18-month rats was much stronger than that of 6th day of culture from 6-month rats (p＜0.001). Conclusion： Senescent marker shows cultured hippocamal neurons from older rats enter senescent status earlier than that from younger rats.

Key words： Hippocampal neuron; Senescence; Senescence associated β-galactosidase