橡膠樹(shù)死皮病黃色體蛋白質(zhì)組差異分析與初步鑒定

摘要:應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophshiya/oresis，2-DE)，比較橡膠樹(shù)死皮株與健康株膠乳黃色體蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異。采用TCA/丙酮沉淀法提取橡膠樹(shù)死皮株與健康株黃色體蛋白質(zhì)，并采用固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)雙向凝膠電泳分離兩種材料蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)銀染顯色后，用PDQuest圖像分析軟件進(jìn)行比較分析#65380;識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。成功獲得了橡膠樹(shù)死皮株與健康株膠乳黃色體的雙向凝膠電泳圖譜。鑒定出24個(gè)蛋白差異點(diǎn)，其中17個(gè)上調(diào)表達(dá)，7個(gè)下調(diào)表達(dá)。并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了其中部分表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)滲調(diào)蛋白進(jìn)行了功能分析，其在死皮株中表現(xiàn)下調(diào)的情形可能與死皮病的發(fā)生有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞:巴西橡膠樹(shù);死皮病;雙向凝膠電泳;蛋白質(zhì)組;質(zhì)譜

中圖分類(lèi)號(hào):S794.1;S763.19;Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2008)08-0858-05

巴西橡膠樹(shù)[Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Muell.-Arg.]的膠乳中含有大量特化的液泡——黃色體，它具有多種生理功能[1]，約占膠乳鮮重的15%~30%。通過(guò)割膠收集的膠乳經(jīng)超速離心后，可以得到黃色體#65380;F-W復(fù)合體#65380;橡膠離子和C-乳清(胞質(zhì)溶液)等4個(gè)主要組分。新鮮膠乳中超過(guò)25%的總可溶性蛋白質(zhì)存在于以黃色體為主的離心底層沉淀部分，黃色體中除含有豐富的蛋白質(zhì)以外，還含有酶和Ca#65380;Mg等二價(jià)陽(yáng)離子，它們能夠調(diào)節(jié)黃色體內(nèi)外的電勢(shì)差，維持著黃色體和膠乳的穩(wěn)定性[2，3]。這種類(lèi)似于植物的液泡和動(dòng)物細(xì)胞中的溶酶體的黃色體小泡在橡膠樹(shù)死皮病(Tapping panel dryness，TPD)發(fā)生時(shí)，在生理上發(fā)生了多種變化，表現(xiàn)為黃色體膜破裂，釋放二價(jià)金屬陽(yáng)離子等致凝物質(zhì)，使膠乳在原位凝固，核DNA發(fā)生凝聚，黃色體膜上的NAD(P)H氧化酶#65380;細(xì)胞質(zhì)過(guò)氧化物酶被誘導(dǎo)激活等等。橡膠樹(shù)TPD被認(rèn)為是一種由傷害(割膠)和乙烯刺激(現(xiàn)生產(chǎn)上普遍采用的增產(chǎn)措施)引起的復(fù)雜生理綜合癥[4，5]。橡膠樹(shù)死皮病發(fā)生時(shí)，割線的局部或全部乳管堵塞，排膠量大大減少甚至不排膠，嚴(yán)重時(shí)樹(shù)皮產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)或斑紋#65380;樹(shù)皮增厚#65380;樹(shù)皮爆裂和割面變形的癥狀。其在各國(guó)各地區(qū)發(fā)病率雖有差異，但基本上都在14%~30%，有的局部地區(qū)甚至高達(dá)50%[6]。這給橡膠種植業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害，是天然橡膠單產(chǎn)提高的限制因子。據(jù)估算，全世界每年因橡膠樹(shù)死皮病而損失的干膠產(chǎn)量為5×105t，價(jià)值相當(dāng)于4億美元[7]。因此，對(duì)于橡膠樹(shù)死皮病的研究不僅在理論上而且在生產(chǎn)實(shí)踐中都有著重要的意義。

了解橡膠樹(shù)死皮病的形成及其分子機(jī)制是治理橡膠樹(shù)死皮病的前提，為尋找死皮發(fā)病原因和探索死皮機(jī)理，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者從不同學(xué)科角度做了不懈的努力。目前，關(guān)于橡膠樹(shù)TPD發(fā)生機(jī)理的假說(shuō)甚多，但大多強(qiáng)調(diào)單個(gè)或幾個(gè)因子的作用，缺乏在蛋白質(zhì)水平上的系統(tǒng)整合研究，而蛋白質(zhì)組技術(shù)為分離和鑒定橡膠樹(shù)黃色體蛋白提供了行之有效的研究手段。它利用高分辨雙向電泳等技術(shù)對(duì)復(fù)雜組織進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，然后采用生物質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。差異蛋白質(zhì)組是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)主要內(nèi)容，差異蛋白質(zhì)組學(xué)的重心在于尋找和篩選某種特定的因素引起的細(xì)胞或組織樣本之間的蛋白質(zhì)組差異，揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)#65380;探查細(xì)胞或機(jī)體對(duì)外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑，以及細(xì)胞調(diào)控的機(jī)制，同時(shí)對(duì)某些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定性和功能分析。一旦能夠獲得蛋白質(zhì)組差異的足夠信息，從理論上來(lái)說(shuō)就可以推斷造成這種變化的原因。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)和差異蛋白質(zhì)組學(xué)水平，對(duì)黃色體蛋白進(jìn)行全面的分離和鑒定，通過(guò)比較橡膠樹(shù)死皮株與健康株膠乳黃色體蛋白質(zhì)表達(dá)譜，找到并鑒定出顯著差異表達(dá)蛋白，就可從一定程度上解釋引起TPD發(fā)生#65380;發(fā)展的原因，也將為進(jìn)一步闡明橡膠樹(shù)死皮病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)橡膠樹(shù)死皮病的防治。

1材料與方法

1.1材料與試劑

橡膠材料選自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)5隊(duì)種植的橡膠品種熱研879，膠樹(shù)割齡11年。

試劑方面，固相pH梯度預(yù)制干膠條(ReadyStrip IPG strip，17 cm，pH3~10或pH5~8)#65380;載體兩性電解質(zhì)[Bio-LyteTM 3/10 Ampholyte，40%(W/V，下同)或Bio-LyteTM 5/8 Ampholyte，40%]#65380;Tributylphosphine(TBP)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;丙烯酰胺(acrylamide)#65380;甲叉雙丙烯酰胺(N，N′-methylenebisacrylamide)#65380;甘氨酸(Glycine)#65380;十二烷基磺酸鈉(SDS)#65380;甘油(Glycerol)#65380;三氨基甲烷(Tris)#65380;硫脲(Thiourea)#65380;3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)#65380;二硫蘇糖醇(DTT)#65380;溴酚藍(lán)(Bromophenol Blue)#65380;四甲基乙二胺(TEMED)#65380;過(guò)硫酸銨(APS)#65380;硝酸銀(AgNO3)#65380;礦物油(Mineral Oil)#65380;瓊脂糖(Agarose)#65380;三氯乙酸(TCA)#65380;鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)#65380;硫代硫酸鈉(Na2S2O3#8226;5H2O)#65380;EDTA-二鈉( EDTA-Na2)#65380;苯甲基磺酰氟(PMSF)和碘乙酰胺(Iodoacetamide)購(gòu)自AMRESCO公司;乙腈(ACN)#65380;α-氰-4-羥基肉桂酸(CCA)和三氟乙酸(TFA)購(gòu)自Fisher公司;TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶(Trypsin Gold)購(gòu)自Promega公司;超純尿素(Urea)和碳酸氫銨(NH4HCO3)購(gòu)自BBI公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Forments公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1樣品的處理和收集以割線整齊#65380;割面無(wú)條漬瘍病的正常排膠的膠樹(shù)6株做對(duì)照，強(qiáng)乙烯利(5 %)連續(xù)刺激2個(gè)半月(每14~15 d為一涂藥周期)，試驗(yàn)期間按常規(guī)割制d/4。試驗(yàn)后測(cè)量割線死皮長(zhǎng)度與割線總長(zhǎng)度，計(jì)算死皮百分率約為60%~80 %，割膠后冰鎮(zhèn)收集前2~30 min排出的膠乳，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2黃色體蛋白質(zhì)的制備將膠乳直接于4℃#65380;26 000 r#8226;min-1離心2 h進(jìn)行分層，取底層沉淀部分(黃色體部分)加入4倍體積的#65380;-20℃預(yù)冷的含10%的TCA#65380;2 mmol#8226;L-1 DTT的丙酮溶液中，-20℃沉淀4 h以上，于4℃#65380;18 000 r#8226;min-1離心20 min，棄上清，將沉淀再懸浮于-20℃預(yù)冷的2 mmol#8226;L-1

DTT的丙酮溶液中，-20℃沉淀2 h，于4℃，16 000 r#8226;min-1離心15 min，棄上清，懸浮#65380;沉淀步驟總共重復(fù)3次，最后將沉淀真空干燥(4℃)，得到粗蛋白質(zhì)，-80℃密封保存?zhèn)溆?。將提取出?lái)的蛋白質(zhì)粉末，以1 mg∶10 μL的比例加入蛋白質(zhì)裂解液(7 mol#8226;L-1尿素，2 mol#8226;L-1硫脲，2 mmol#8226;L-1TBP，4%CHAPS，40 mmol#8226;L-1Tris)靜置1 h，間斷渦旋振蕩，待其充分溶解后，于20℃，15 000 r#8226;min-1，離心10 min，去除不溶性沉淀，上清液即為蛋白質(zhì)溶液。取上清，按照Bradford方法[8]略作修改對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，立刻進(jìn)行雙向電泳(2-DE)測(cè)試;或者分裝后，于-80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3雙向凝膠電泳(2-DE)①第一向?yàn)楣滔鄍H梯度(immobilized pH gradiear，IPG)。等電聚焦主要按Gorg等[9]的方法和IPG phorTM等電聚焦指南描述的方法進(jìn)行一些改進(jìn)，分別于pH3~10或pH5~8的IPG膠條中加入樣品蛋白150 μg或200 μg，與重水化液(7 mol#8226;L-1尿素，2 mol#8226;L-1硫脲，2 mmol#8226;L-1

TBP，4%CHAPS，0.2% Bio-Lyte pH3~10或0.2% Bio-Lyte pH5~8，0.002%溴酚藍(lán))混合，總體積為300 μL。將蛋白與水化液充分混合后移入IPG phor等電聚焦儀的膠條槽(IPG strip holder)中，小心放入17 cm IPG干膠條，覆蓋礦物油，在IPG phor等電聚焦儀上進(jìn)行主動(dòng)水化和等電聚焦。水化和聚焦在18℃條件下進(jìn)行，總電壓時(shí)間積為72 450 Vh，其中水化在50 V低電壓進(jìn)行14 h，然后經(jīng)過(guò)250 V#65380;1 h，500 V#65380;1 h，1 000 V#65380;1 h，最后穩(wěn)定在10 000 V下進(jìn)行。②膠條平衡和第二向垂直平板SDS-PAGE。等電聚焦結(jié)束后，每根IPG膠條用6 mL含SDS的平衡液(0.375 mol#8226;L-1Tris-HCl#65380;pH8.8，6 mol#8226;L-1Urea，20%(V/V)Glycerol，2%SDS)平衡2次，每次15 min。第1次平衡液中含2%DTT，而第2次平衡液中DTT由2.5%的碘乙酰胺代替。將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至1.0 mm厚的連續(xù)12.5%的SDS-聚丙烯酰胺均質(zhì)膠上端，膠條一端置低分子量蛋白Marker。排凈氣泡用0.5%的瓊脂糖封膠液封頂固定膠條，SDS-PAGE在PROTEAN Plus DodecaTM電泳槽中進(jìn)行，17℃循環(huán)水冷卻，采用恒壓方式電泳，初始電壓100 V，電泳15 min后，電壓提高至200 V，直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)膠邊緣處為止。

1.2.4凝膠染色參照文獻(xiàn)[10]和[11]的方法修改后并加以改進(jìn)進(jìn)行銀染。40%(V/V)乙醇+10%(V/V)冰醋酸固定30 min;30%(V/V)乙醇+0.2%硫代硫酸鈉+6.8%無(wú)水乙酸鈉致敏30 min;超純水漂洗2次，每次10 min;0.25%硝酸銀+0.04%(V/V)的37%甲醛銀染20 min;超純水漂洗2次，每次1 min;2.5%無(wú)水碳酸鈉+0.02%(V/V)的37%甲醛顯影至蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰出現(xiàn)為止;1.46% EDTANa2#8226;2H2O溶液終止10 min;超純水漂洗10 min;然后于4℃#65380;1%冰醋酸溶液中保存。上述各步驟皆在搖床上進(jìn)行。

1.2.5凝膠圖像掃描與分析顯色后的雙向電泳凝膠用Bio-Rad的GS-800TM校準(zhǔn)光密度掃描儀透射掃描，采集圖像，同一處理的二維電泳重復(fù)3 次，利用PDQuest7.40圖像分析軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正#65380;斑點(diǎn)檢測(cè)#65380;背景消減#65380;選擇參考膠以及圖譜的匹配。同時(shí)定義蛋白質(zhì)點(diǎn)的大小#65380;強(qiáng)弱#65380;檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目，計(jì)算蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量等，利用圖像匹配分析將獲得的3個(gè)電泳圖進(jìn)行整合，制成標(biāo)準(zhǔn)電泳圖，將標(biāo)準(zhǔn)電泳圖的光學(xué)密度圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，根據(jù)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)表達(dá)量的變化進(jìn)行比較和分析，尋找蛋白質(zhì)差異點(diǎn)。以蛋白質(zhì)的數(shù)字信號(hào)相差超過(guò)2倍確定上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)，相差低于0.5倍為基本保持不變。

1.2.6質(zhì)譜分析①膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶解及質(zhì)譜鑒定。參照Promega的Trypsin(Mass Spectrometry Grade)使用說(shuō)明書(shū)的方法修改后，并加以改進(jìn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的切取及膠內(nèi)酶解。用適當(dāng)加工的移液器tip頭將目的蛋白質(zhì)點(diǎn)沿染色邊緣切下，放入樣品管中，加入200 μL新鮮的脫色工作液[30 mmol#8226;L-1 K3Fe(CN)6與100 mmol#8226;L-1 Na2S2O3#8226;5H2O溶液，按體積比1∶1混合后形成]放置1~2 min后，可見(jiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)的棕色消失，此時(shí)馬上用水沖洗，停止反應(yīng)，移去其中的溶液，加入200 μL水，放置20 min，洗滌，重復(fù)2次，至膠粒由黃色變成無(wú)色，加入100 μL的100%ACN，在室溫下濃縮膠粒5 min，真空冷凍抽干，將1 μg#8226;μL-1的Trypsin儲(chǔ)液溶于40 mmol#8226;L-1

NH4HCO3/10%ACN溶液，使其終濃度為20 μg#8226;mL-1，

每管加10 μL于4℃預(yù)溫育1 h后將多余的酶液棄去，覆蓋20 μL酶消化緩沖液(40 mmol#8226;L-1NH4HCO3/10% ACN)于37℃酶解消化16~18 h，之后加入50 μL抽提液(50%ACN/5%TFA)萃取60 min，抽提肽片段，重復(fù)抽提1次，最后將2次抽提液合并，真空冷凍抽干濃縮。將上述樣品重新溶解在適量含5 mg#8226;mL-1CCA的50%ACN+0.1%TFA中，取1 μL酶解肽段進(jìn)行MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜分析。②肽質(zhì)指紋圖譜(PMF)。將獲得的肽質(zhì)指紋圖譜(PMF)信息進(jìn)行內(nèi)部校正，去除胰蛋白酶的自動(dòng)降解峰#65380;角蛋白的特征峰以及背景雜質(zhì)峰，將校準(zhǔn)后的圖譜轉(zhuǎn)化為單同位素峰，選取圖譜中信噪比較好#65380;分辨率較高#65380;離子峰相對(duì)較高且處于1 000~

3 000 Da之間的肽段進(jìn)行同源性查詢。該項(xiàng)分析委托北京華大蛋白質(zhì)研究中心來(lái)完成。③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。用MASCOT(www.matrixscience.com)軟件及NCBInr上真核細(xì)胞的非冗余蛋白庫(kù)，對(duì)獲得的混合物肽片段數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，物種為Green plant，搜庫(kù)參數(shù)為Fixed modifications:carbamidomethyl;Variable modifications:oxsidation;Mass values:Monoisotopic;Protein Mass:Unrestricted;Fragment Mass Tolerance:±0.5 Da;Max Missed Cleavages:0。結(jié)果的可信度根據(jù)mascot的評(píng)分(P<0.05)標(biāo)準(zhǔn)判斷。

2結(jié)果與分析

2.1死皮株與健康株膠乳黃色體雙向凝膠電泳

試驗(yàn)對(duì)膠乳黃色體蛋白進(jìn)行了3次雙向電泳重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果3次雙向電泳圖譜非常相似，有較高的重復(fù)性，說(shuō)明結(jié)果穩(wěn)定可信。用PDQuest 7.40圖像分析軟件進(jìn)行點(diǎn)分析，將其中的一塊膠定為參考膠，進(jìn)行3塊膠之間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配，組內(nèi)圖像匹配率均可達(dá)89%以上，匹配率較高，能滿足2D分析的需要。

先采用pH3~10的固相IPG膠條進(jìn)行橡膠樹(shù)死皮株與健康株膠乳黃色體蛋白2-DE分離，圖譜經(jīng)斑點(diǎn)檢測(cè)后，進(jìn)行凝膠匹配，死皮株與健康株2-DE圖譜間的匹配率為79%，經(jīng)PDQuest 7.40軟件分析后，共檢測(cè)到了大約700個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，差異蛋白點(diǎn)主要集中在pH5~8的范圍內(nèi)，經(jīng)比對(duì)分析，兩者表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)有11個(gè)。其典型的2-DE 圖譜見(jiàn)圖1。

為提高蛋白質(zhì)點(diǎn)的分辨率，進(jìn)一步采用窄范圍(pH5~8)的固相IPG膠條進(jìn)行2-DE分析，可將上樣量增大至200 μg，結(jié)果顯示，用pH5~8的膠條進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離效果好，分辨率大大提高。蛋白質(zhì)的分布范圍較廣，大多數(shù)集中在20~70 kD區(qū)域，pH5~8上幾乎均勻分布，有助于一些低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢出。經(jīng)銀染和PDQuest 7.40軟件分析后，確定在死皮株與健康株膠乳黃色體中可檢出大約850個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，死皮株與健康株黃色體的2-DE圖譜匹配率為84%，進(jìn)一步檢測(cè)出13個(gè)表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)。其典型的2-DE圖譜見(jiàn)圖2。

2.2差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

選取pH5~8的2D膠上的3個(gè)具有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)spot4#65380;spot6#65380;spot12，經(jīng)膠內(nèi)酶切和肽段提取后，進(jìn)行MS或MS/MS測(cè)定，得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)或肽序列標(biāo)簽(PST)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合2-DE圖譜上相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子量#65380;等點(diǎn)電，確定其中1個(gè)蛋白為滲調(diào)蛋白(osmotin);另外2個(gè)蛋白還要進(jìn)一步確定。以spot6為例，應(yīng)用MALDI-TOF-TOF，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，圖3(A)為分子量1776.8002肽段的MS/MS圖譜，這段肽的氨基酸序列推斷為NNCPYTVWAAASPGGGR。測(cè)定肽段氨基酸序列采用Matrix Science(http://www. Matrix. science.com)的Mascot軟件，在SWISS-PROT或NCBInr中進(jìn)行自動(dòng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，檢索結(jié)果如圖3(B)所示。該蛋白鑒定為osmotin，由177個(gè)氨基酸組成，我們得到4個(gè)匹配肽段，氨基酸覆蓋率為23%。

3討論

Dian等研究發(fā)現(xiàn)在死皮植株中乳管C-乳清的2個(gè)蛋白質(zhì)(26 ku和24.5 ku)較健康樹(shù)有大量增加;而一些胞質(zhì)蛋白卻有所減少[12]。Lacrotte在單向SDS-PAGE電泳中發(fā)現(xiàn)22 ku胞質(zhì)蛋白含量明顯增加，而且其增加量與發(fā)病的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。Sookmark等得到了2種在死皮樹(shù)中大量積累的蛋白質(zhì)，分別命名為P15和P22[14]。隨后的鑒定證明，P15就是橡膠延伸因子Hevb1，P22是小橡膠粒子蛋白Hevb3。這些蛋白均為橡膠膠乳中高豐度蛋白質(zhì)。通過(guò)公開(kāi)文獻(xiàn)檢索，目前國(guó)內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)在橡膠樹(shù)死皮方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離橡膠樹(shù)健康株和死皮株膠乳黃色體蛋白質(zhì)，建立了雙向凝膠電泳圖譜，初步對(duì)二者差異顯著蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。

造成死皮的生產(chǎn)上強(qiáng)割和強(qiáng)乙烯刺激，可以認(rèn)為是外界施加的逆境脅迫，研究已經(jīng)證明，橡膠樹(shù)死皮病是由強(qiáng)割和強(qiáng)乙烯刺激引起的程序性細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[15]。而植物細(xì)胞程序性死亡的最主要特點(diǎn)是液泡破裂和核DNA凝聚[16，17]。各種逆境對(duì)細(xì)胞的最大傷害就是破壞膜系統(tǒng)和大分子結(jié)構(gòu)。滲調(diào)蛋白(osmotin)是植物在滲透脅迫下產(chǎn)生的一種適應(yīng)性蛋白，其在植物抗逆反應(yīng)中起著重要的作用，被人們稱為植物的免疫蛋白。滲調(diào)蛋白在植物逆境生理中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)與許多逆境和環(huán)境因子有關(guān)[18]。在逆境條件下，植物誘導(dǎo)合成的許多蛋白(例如滲調(diào)蛋白)和一些還原性的糖類(lèi)，可以用來(lái)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。在本研究中，滲調(diào)蛋白在死皮株膠乳黃色體中的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，我們認(rèn)為這與死皮樹(shù)膠乳黃色體膜出現(xiàn)破裂現(xiàn)象有一定的關(guān)系。

橡膠樹(shù)黃色體蛋白在死皮株與健康株之間存在著明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，主要表現(xiàn)為DE圖譜斑點(diǎn)的增減以及染色的深淺上，一些蛋白質(zhì)(如spot4#65380;spot12)的表達(dá)量有所增加，而另一些蛋白質(zhì)(如spot6)則有所降低。本研究選定3個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，但最終僅鑒定出1種蛋白，其原因可能是二維電泳的分辨力或質(zhì)譜分析敏感性的限制，以及部分蛋白可能是未發(fā)現(xiàn)的新蛋白。要真正闡明這些差異點(diǎn)與橡膠樹(shù)死皮之間的關(guān)系還有很多工作要做，在此試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，今后可以對(duì)更多的差異點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析，并對(duì)部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)一系列分析技術(shù)的不斷完善，對(duì)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生#65380;發(fā)展的過(guò)程將有一個(gè)較全面的了解。

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