熒光定量ＰＣＲ檢測１０３例外周血中ＡＦＰｍＲＮＡ結(jié)果分析

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界十大惡性腫瘤之一，我國每年死于肝癌的人數(shù)約為11萬，占世界死亡總數(shù)的40%左右。為了早期發(fā)現(xiàn)早期診斷達(dá)到早期治療原發(fā)性肝癌，我們采用熒光PCR定量檢測外周血中AFPmRNA，報告如下。

材料與方法

材料：收集住院確診的原發(fā)性肝癌患者標(biāo)本40例(肝外轉(zhuǎn)移20例，無肝外轉(zhuǎn)移20例)，慢性肝炎患者標(biāo)本20例，肝硬化患者標(biāo)本17例，健康人26例。

儀器：自動熒光PCR分析儀，免疫分析儀。

試劑：AFP試劑盒。

熒光定量PCR檢測AFPmRNA方法的建立：①引物、探針的設(shè)計、合成從GenBank中調(diào)出AFP的DNA和RNA序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，上游引物位于外顯子1和2之間，序列為5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′。下游引物位于外顯子3上，序列為5′-CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT-3′。②MGB探針的設(shè)計、合成：根據(jù)PE公司提供的引物探針設(shè)計軟件，設(shè)計的MGB探針的序列如下：5′-TACTGCAGAGATAAGTTT-3′。 

熒光定量PCR檢測外周血中AFPmRNA的檢測：①熒光PCR檢測外周血中AFPmRNA：標(biāo)本收集和總RNA的提取：各組于晨起空腹抽外周靜脈血5ml，枸櫞酸鈉抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液密度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PMNC)。標(biāo)本凍于-80℃用TRInol試劑提取PMNC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。②熒光定量PCR檢測外周血中AFPmRNA反應(yīng)體系：5×PCR buffer 10μl，上下游引物各0.3μmol/L，10mmol dNTPs 1μl，探針0.06μmol/L，Taq DNA聚合酶3U，cDNA或陽性模板5μl，加無菌去離子水至50μl。加5μl于不同的反應(yīng)管中，在PE7700擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，93℃ 30秒，60℃ 1分鐘，共40個循環(huán)，所有反應(yīng)信息資料被PE7700擴(kuò)增儀收集并儲存于其附件Macintosh電腦(含相應(yīng)的分析軟件)中，反應(yīng)結(jié)束后該電腦根據(jù)陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增情況自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)陽性定量模板和待測樣本的擴(kuò)增情況，算出反應(yīng)體系中待測樣本中cDNA的拷貝數(shù)。

結(jié) 果

26例健康人AFPmRNA均陰性

肝病患者AFPmRNA的檢測結(jié)果，見表1。

21例原發(fā)性肝癌AFPmRNA陽性標(biāo)本血清中AFP陰性7例。

AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例，Ⅱ期11例陽性，進(jìn)行24～50個月的追蹤觀察發(fā)現(xiàn)患者外周血AFPmRNA與肝癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。

討 論

熒光定量PCR是近兩年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)［1~3］。熒光定量PCR技術(shù)既巧妙地利用了PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增的高效性，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性及計量高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，同時又克服了普通PCR技術(shù)易污染，不能定量，探針雜交靈敏度不高，分離洗脫條件不易控制等不足，在疾病的基因診斷中有廣闊的應(yīng)用前景。

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血中AFPmRNA在40例肝癌患者中72.5%(29/40)陽性，期中肝外轉(zhuǎn)移陽性率100%(20/20)，無肝外轉(zhuǎn)移陽性率45%(9/20)，慢性肝炎10%(2/20)，肝硬化23.5%(4/17)。表明外周血中AFPmRNA檢測出率與肝腫瘤大小、臨床分期及有無肝外轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。

原發(fā)性肝癌(肝外轉(zhuǎn)移、無肝外轉(zhuǎn)移)、肝硬化AFPMRNA拷貝在1.42E4～7.69E8之間，而慢性肝炎AFPmRNA拷貝僅在1.08E3～5.21E5之間，提示AFPmRNA在外周血中的數(shù)量與病情有密切關(guān)系。

AFPmRNA早期肝癌Ⅰ期6例陽性，Ⅱ期11例陽性，進(jìn)行24～50個月追蹤觀察發(fā)現(xiàn)患者外周血AFPmRNA與肝癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。提示AFPmRNA的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長［6］，推測外周血中AFPmRNA也許是肝癌在早期復(fù)發(fā)的一個指標(biāo)，并且連續(xù)檢測外周血AFPmRNA可以作為一個預(yù)后因子。

在21例原發(fā)性肝癌AFPmRNA陽性標(biāo)本血清中AFP有7例陰性，說明AFPmRNA比血清AFP更敏感，聯(lián)合檢測外周血中AFPmRNA可能有助于提高血清AFP陰性或低陽性肝癌的診斷靈敏度，在慢性活動性肝炎和肝硬化的惡變的檢測和肝癌的早期診斷上也可能有一定的意義。

參考文獻(xiàn)

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2 Livak KJ，F(xiàn)lood SJA，Marmaro J，et al.Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization.PCR Methods Appl，1995，4(6):357-362.

3 Haid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.Real time quantitative PCR.Genome Research，1996，6(10):986-994.

4 Matsumura M，Niwa Y，Kato N，et al.Hepatology，1994，20:1418-14.

5 Niwa Y，Matsumura M，Shiratori Y，et al.Quantitation of alpha-fetoprotein and albumin messenger RNAs in human hepatocellular carcinoma.Hepatology，1996，23(6):1384-1392.

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7 劉楊，張柏和，陳漢，等.巢式RT-PCR定量檢測肝癌、癌旁組織及正常肝組織內(nèi)AFPmRNA.肝膽胰外科雜志，2001，13(1):6-7.