應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對高脂血癥患者外周血血小板白細(xì)胞聚集體的研究

科研課題 福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助(編號2001-1-19)

摘 要 目的：研究高脂血癥與外周血血小板白細(xì)胞聚集體的關(guān)系。方法：運用流式細(xì)胞術(shù)檢測4組樣本，即對照組、高脂血癥1組(HDL-C≥0.9mmol/L)、高脂血癥2組(HDL-C<0.9mmol/L)、心腦血管病變組中血小板白細(xì)胞聚集體、血小板中性粒細(xì)胞聚集體和血小板單核細(xì)胞聚集體的百分比。結(jié)果：高脂血癥組和高脂血癥1組與對照組比較，PLA和PNA的比例差異無顯著性，PMA的比例高于對照組(P<0.05)；高脂血癥2組和心腦血管病變組與對照組比較，PLA、PNA和PMA均高于對照組(P<0.05)，且高脂血癥2組PLA和PNA均高與高脂血癥1組。結(jié)論：PLA是監(jiān)測高脂血癥引起動脈粥樣硬化和血栓的敏感指標(biāo)，測定白細(xì)胞亞群與血小板的聚集體比測定血小板與總白細(xì)胞聚集體更有意義。

關(guān)鍵詞 流式細(xì)胞術(shù) 高脂血癥 血小板白細(xì)胞聚集體

材料與方法

研究對象：高脂血癥組選擇2007年3～11月高脂血癥患者41例，男29例，女12例，年齡31～72歲，平均47歲。入選標(biāo)準(zhǔn)參照1997年我國制訂的血脂異常防治建議，血清總膽固醇(TC)>5.20mmol/L和(或)甘油三酯(TG)≥1.70mmol/L，排除肝腎疾病、炎癥以及繼發(fā)性高脂血癥。根據(jù)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度分為兩組：高脂血癥1組(HDL-C≥0.9mmol/L)和高脂血癥2組(HDL-C<0.9mmol/L)。心腦血管病變組25例，男16例，女9例，年齡37～56歲，平均44歲。對照組選用健康體檢者20例，其中男10例，女10例，年齡20～46歲，平均34歲。

檢測儀器及試劑：單克隆抗體CD45-PC5，CD41-PE；EPICS XL型流式細(xì)胞儀。

樣本采集及處理：采血(檸檬酸鈉抗凝)后，立即將1ml全血加入1ml 4%多聚甲醛固定液中，4℃固定1小時，Tyrode氏緩沖液(NaCl 137.5mmol/L，MgCl₂ 2mmol/L，KCl 2.6mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L，NaHCO₃ 12mmol/L，0.1%BSA，pH7.4)洗滌，1500g離心15分鐘，共3次。取洗滌后的樣本10μl，加入檢測抗體各10μl，室溫避光孵育20分鐘，用Tyrode氏緩沖液稀釋成1ml，上機(jī)檢測。

流式細(xì)胞儀分析：使用CD45-PC5/SSC設(shè)備，將外周血白細(xì)胞分為中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞3個細(xì)胞群，用淋巴細(xì)胞群調(diào)整CD41表達(dá)在0.5%～1.5%，分別記錄血小板白細(xì)胞聚集體(PLA)、血小板中性粒細(xì)胞聚集體(PNA)和血小板單核細(xì)胞聚集體(PMA)的百分比。

結(jié)果分析：流式細(xì)胞儀采集后的數(shù)據(jù)用軟件SYSTEMTM Ⅱ SOFTWARE和WinMDI2.8分析。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，兩兩比較用t檢驗。

結(jié) 果

見表1。高脂血癥組和高脂血癥1組與對照組比較，PLA和PNA的比例差異無顯著性，PMA的比例高于對照組(P<0.05)；高脂血癥2組和心腦血管病變組與對照組比較，PLA、PNA和PMA均高于對照組(P<0.05)，且高脂血癥2組PLA和PNA均高與高脂血癥1組。

討 論

動脈粥樣硬化性血栓形成的時候，血小板和白細(xì)胞被激活后分泌的趨化因子和細(xì)胞因子除可促進(jìn)血小板和白細(xì)胞自身聚集外，還可促進(jìn)血小板與白細(xì)胞結(jié)合，本資料結(jié)果與Habazettl等報道一致。

本研究提示HDL-C與AS發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)血漿HDL-C<0.9mmol/L時心腦血管疾病發(fā)生動脈粥樣硬化和血栓的危險性顯著增加，與趙氏^[1]等報道一致。此外，本研究還提示血小板與白細(xì)胞的結(jié)合先始于血小板與單核細(xì)胞的結(jié)合，然后再進(jìn)一步與中性粒細(xì)胞結(jié)合，其中的機(jī)制可能是，血脂紊亂會損傷內(nèi)皮功能，尤其氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)可作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過減少內(nèi)皮一氧化氮(EDNO)合成或釋放，抵制內(nèi)皮細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)或內(nèi)膜上EDNO的分解，引起內(nèi)皮細(xì)胞釋放氧自由基引起的氧化。損傷的內(nèi)皮一方面通過內(nèi)皮下暴露的膠原激活血小板，另一方面通過上調(diào)其表面ICAM-1、E-選擇素、P-選擇素等表達(dá)募集單核細(xì)胞，后者又可激活內(nèi)皮細(xì)胞而誘導(dǎo)其上的粘附分子表達(dá)以使更多的單核細(xì)胞浸潤，形成血小板和單核細(xì)胞的聚集體，聚集體的形成明顯的加強(qiáng)了血小板與白細(xì)胞之間的相互作用^[2]，進(jìn)一步形成血小板和中性粒細(xì)胞聚集體。

綜上所述，PLA是監(jiān)測高脂血癥引起動脈粥樣硬化和血栓的敏感指標(biāo)，測定白細(xì)胞亞群與血小板的聚集體比測定血小板與總白細(xì)胞聚集體更有意義，但很多因素，如溫度，餐后血脂、檢測儀器和血樣的保存時間對PLA的形成均有明顯影響，從而可能導(dǎo)致研究結(jié)果之間出現(xiàn)較大差異，因此，還需要用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和大樣本臨床試驗解決上述問題。

參考文獻(xiàn)

1 趙玫，白小娟，等.血脂代謝紊亂作為心肌梗死對患病危險因素的相關(guān)研究.中國循環(huán)雜志，2000，15(1)：13-15.

2 Li N，Hu H，Lindqvist M，et al Platelet-leukocyte cross talk in whole blood Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20：2702-2708