菠蘿蜜遺傳多樣性的ＩＳＳＲ分析

摘要：用ISSR標記方法對76份菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)種質資源DNA的遺傳多樣性進行了檢測，24個引物共檢測到477條帶，其中427條具多態性(占89.52％)，平均PIC為0.23，24個引物能把76份種質完全區分開來。遺傳距離分析結果顯示供試種質的遺傳多樣性較低，在DNA水平上的遺傳相似系數為0.626～0.945，平均為0.775。聚類分析表明，76份菠蘿蜜材料在遺傳距離系數為0.752處可分為4大類，其中熱帶植物園的種質WJ2和GSYWJl與其他種質的遺傳距離相對較大，干胞和濕類型不能獨立聚類。另外各地區的種質與雷州半島種質明顯分開聚類，而雷州半島各地區的種質混雜聚類在一起，不能按地區單獨聚類。

關鍵詞：菠蘿蜜；種質資源；遺傳多樣性；ISSR

中國分類號：S667.99

文獻標識碼：A

文章編號：1009—9980(2009)05—659—07

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)，?？颇静ぬ}屬，又稱木菠蘿、樹菠蘿、大樹菠蘿等，英文名Jackfruit，jakfruit，Jacquiet等。菠蘿蜜是世界著名的熱帶水果，其果肉肥厚柔軟，清甜可口，香味濃郁，深受人們喜愛，現主要栽植在印度、斯里蘭卡、馬來西亞、孟加拉國、緬甸和我國的華南等南半球熱帶低海拔地區，澳大利亞、非洲及南美地區也有少量種植。菠蘿蜜引入我國已有近1000a的歷史，現在主要栽培在華南的海南、云南、臺灣、廣東等地。

菠蘿蜜種質間樹體的形態差異較小，用常規方法難以鑒別，特別是在苗期對不同品種的鑒定尤為困難。利用分子標記對菠蘿蜜種質資源進行分析，國內外已經有相關的報道，但主要是運用AFLP和RAPD標記，而利用ISSR標記對菠蘿蜜種質資源的研究尚未見報道。

ISSR(簡單重復序列區間擴增多態DNA)是建立在PCR反應基礎上的一種分子標記技術，由Zi-etkiewicz等于1994年發明。它結合了SSR和RAPD的優點，具有RAPD的操作簡單，所需DNA量少，不需預知研究對象的基因組序列等優點，并具有SSR的穩定性。ISSR標記在果樹遺傳多樣性研究的應用，國內外也已經有相關的報道。我們利用ISSR分子標記方法對76份菠蘿蜜種質資源進行遺傳多樣性分析，希望為菠蘿蜜的分子鑒定和種質資源的篩選提供依據，為開展優良菠蘿蜜品種選育工作奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

供試的78份材料中，包括76份菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam，)種質，其中，雷州半島種質64份、云南種質1份、海南種質3份、巴基斯坦的種質2份、馬來西亞種質6份，2份尖蜜拉種質[Artocarpuschampeden(Lour.)Spren]，YN-JML和zJ-JML。植株編號及取樣地點見表1。田間采集試驗植株的葉片。置于液氮中運輸、保存。

試驗試劑Mg²⁺、dNTP_s、TaqDNA聚合酶等購自北京鼎國生物技術有限責任公司。ISSR引物序列來自加拿大的University0fBritishColumbia，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，共60條。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和質量的檢測 參照葉春海等的改良CTAB法來提取菠蘿蜜基因組DNA。采用紫外可見分光光度計(UV-2802，上海美達儀器有限公司)法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量，并根據Auo值把DNA提取液稀釋為25mg·L^-1然后用稀釋好的基因組DNA進行后續實驗。

1.2.2 ISSR-PCR擴增和引物篩選 參考王耀輝等建立的菠蘿蜜ISSR反應體系：在20μL反應體系中DNA模板量為1.6mg·L^-1，TaqDNA聚合酶1.25U，引物的濃度0.24μmol·L^－1，dNTP_s的濃度為0.2mmol·L^－1，Mg²⁺濃度為2mmol·L^－1，10xPCR緩沖液2.0μL。PCR擴增反應程序是：94℃預變性4min；94℃變性1min，退火50s(不同引物退火溫度不同)，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。不同引物PCR擴增產物用5％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，2％硝酸銀染色拍照分析。100bp的DNAladder作分子量標記。利用上述反應體系和擴增程序隨機抽取2份菠蘿蜜種質的DNA為模板，從60條ISSR引物中篩選出合適的引物及其對應的退火溫度。

1.2.3 菠蘿蜜種質資源的ISSR分析 用篩選出的引物，在合適的退火溫度下分別對所有菠蘿蜜種質資源進行擴增，再從中挑選出對所有種質資源都能產生良好清晰條帶的引物進行重復擴增，記錄擴增結果。

1.2.4 ISSR標記結果的數據分析 同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，屬于同一位點的產物按擴增陽性(1)和擴增陰性(0)記錄電泳譜帶，形成表型數據矩陣。其中，強帶計為“1”，可重復弱帶計為“1”，不可重復弱帶計為“0”。統計擴增總帶數、多態帶、多態性位點百分率和多態信息含量(polymorphisminformationcontent，PIC)。使用NTSYS-pc2.10軟件計算樣品間(OUT)的表征Nei氏相似性系數并由此計算其相對遺傳距離：對得到的遺傳相似性矩陣進行非加權組法(UPGMA)聚類分析，建立樣品間的親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA的多態性分析

從60條ISSR引物中挑選出了24條對78份種質都能產生良好清晰條帶的引物。用這24條引物，對所研究的78份種質進行重復擴增，并進行統計分析。由于尖蜜拉跟菠蘿蜜是同屬不同種的樹種，所以這里只對76份菠蘿蜜種質的多態性進行分析。表2和圖1是基于76分菠蘿蜜種質的擴增結果所統計出來的結果。而2份尖蜜拉種質只在遺傳相似性和聚類分析中跟76份菠蘿蜜種質加以比較。

從表2可見，24條引物對76份菠蘿蜜種質共計擴增出477條DNA帶，其中多態性DNA帶427條，占總帶數的89.5％，每條引物擴增的DNA帶的數目為7～35條，平均19.88條，多態率66.67～％100％。擴增帶數最多的引物為U857，達35條，擴增條帶數最少的引物為U856，僅為7條。多態性百分率最高的為U810、U825、U851和U857，均達100％，最低的為U848，為66.67％。另外可以看出所用引物中(AC)n有5條，(AG)n有4條，(GA)n、(CA)n各3條，說明菠蘿蜜基因組中可能存在較多的TG、CT二核苷酸重復序列。以上分析表明菠蘿蜜在分子水平上具有豐富的多態性。引物U834的電泳結果如圖2所示。

從圖1可以看出所擴增出的477個位點的多態信息含量(PIC)的總體情況，477個擴增位點的平均PIC為0.23，其中PIC值為0.45～0.50的位點最多，為84個，占了17.61％；而PCI為0.40～0.45的位點最少，為18個，占3.77％。總的來看477個擴增位點的平均PIC值處在中間水平。說明所研究菠蘿蜜種質的遺傳多樣性較低、親緣關系比較近。

2.2 遺傳相似性分析

通過NTSYS-pc2.10軟件對76份菠蘿蜜和2份尖蜜拉共78份種質的ISSR擴增結果(共擴增出503條DNA帶)進行計算，結果表明，76份菠蘿蜜種質之間的遺傳相似系數在0.626～0.945，平均相似系數為0.775，表明這些種質的親緣關系比較近。76份種質包括了我國雷州半島、海南和云南，還有馬來西亞和巴基斯坦的種質。說明了東南亞地區菠蘿蜜種質的親緣關系較近。其中由茂名名富果場引進的2份馬來西亞種質MLXY4和MLXY5的遺傳相似系數最高，為0.945，親緣關系最接近。而同是馬來西亞種質，由徐聞蔬菜水果所引進的MLXY2和MLXY6的遺傳相似系數最低，為0.626，親緣關系最遠。

分別來源于廣東湛江和云南西雙版納的2份尖蜜拉種質ZJ-JML和YN-JML之間的遺傳相似系數為0.7426，表明它們之間存在一定的遺傳差異。尖蜜拉與菠蘿蜜種質的比較發現，zJ-JML與76份菠蘿蜜種質的平均遺傳相似系為0.688，而YN-JML與76份菠蘿蜜種質的平均遺傳相似系為0.5508，表明來源于廣東湛江的尖蜜拉種質與菠蘿蜜種質有較高的親緣關系。

2.3 聚類分析

按UPGMA方法構建了親緣關系樹狀圖(圖3)。在遺傳相似系數0.65～0.95內，24條ISSR引物能將78份材料分開。依據遺傳相似性程度，在遺傳距離系數為0.752處，78份種質可以分為5組，其中2份尖蜜拉種質zJ－JML和YN－JML歸為1組。剩余76份菠蘿蜜種質可分為4組。第1組為來源于海南興隆熱帶植物園的2份干包種質WJ2和GSYWJl，第2組為來源于海南興隆熱帶植物園的LYDS(干包)和云南西雙版納的XSQ5-S(濕包)，第3組為來源于巴基斯坦的2份干包種質BJSTl和BJST2，第4組為剩余的70份菠蘿蜜種質。

另外從樹狀圖可以看出，12份濕包種質(編號帶一S的種質)與其他干包種質混雜聚類在一起。其中來源于云南西雙版納的XSQ5－S與另外11份種質(DKR3-S、DKR2-S、DQEZ-S、LQT8-S、DKRl-S、LOT6-S、LOT4-S、LOTl－S、LQT9-S、LWB-S、SB8-S)的遺傳距離明顯較遠。另外在同一濕包家系的一組實生種質中，DKR1-S與其實生后代DKR2－S，DKR2-S與其實生后代DKR3-S都沒有聚在一起，說明實生后代有較大的分離。還有就是在同一植株的不同主干上(一主干為干胞，另一主干為濕胞)的2份種質(DQEY、DQEZ-S)在聚類樹中聚在一起，2者的特異條帶不能區分其干、濕胞類型。

6份馬來西亞種質中有5份種質(MLXYl、MLXY3、MLXY4、MLXY5、MLXY6)明顯聚在一起，但6份種質均與雷州半島種質聚在同一大組中。而3份海南種質(WJ2、GSYWJl、LYDS)，1份云南種質(XSQ5-S)和2份巴基斯坦種質(BJST1、BJST2)都明顯與雷州半島種質分開聚類。而雷州半島各地區的種質混雜聚類在一起，不能按地區單獨聚類。

3 討論

3.1 菠蘿蜜種質的遺傳多樣性

ISSR標記的平均PIC為0.23，遺傳相似系數在0.5023～0.9447，可見所研究的76份菠蘿蜜種質在DNA水平上的遺傳多樣性并不高，這與國內外的研究結果類似。葉春海等認為，與形態性狀的多樣性相比，菠蘿蜜在DNA水平上較為相似可能是菠蘿蜜自身的特點，反映出該樹種相對較為單一的遺傳背景。但也可能是RAPD分析存在的不穩定性所造成的。而本試驗利用ISSR標記揭示的多態性與他們利用RAPD分析的結果相近，除支持他們的觀點外，這可能還與本研究采用的引物有關。

3.2 菠蘿蜜種質的親緣關系

Schnell等m對來自印度尼西亞、泰國、澳大利亞、柬埔寨、美國和印度等國家26份種質的AFLP分析結果表明，除印度的2份種質單獨聚類外，其他24份種質聚在另外一組，他們認為東南亞地區的菠蘿蜜種質和印度的菠蘿蜜種質在起源上可能是不同的。葉春海等研究指出引自馬來西亞的幾個品種和我國的菠蘿蜜種質資源在分子水平上遺傳差異較小，說明我國菠蘿蜜可能多來自東南亞地區。本試驗研究得出76份菠蘿蜜種質之間的親緣關系比較近，其中包括了我國雷州半島、海南和云南，還有馬來西亞和巴基斯坦的種質，說明了東南亞地區菠蘿蜜種質的親緣關系較近。所以筆者認為東南亞地區的菠蘿蜜種質可能來源于相同的資源區，經過幾千年的演化才形成了今天的遺傳多樣性。另外各地區的種質與雷州半島種質明顯分開聚類，這說明雷州半島種質與其他地區種質之間在DNA水平上可能存在一定的差異，也可能是本試驗中其他地區的種質數較少造成的。而雷州半島各地區的種質混雜聚類在一起，不能按地區單獨聚類，說明雷州半島各地區的菠蘿蜜種質來源背景可能相同。

在尖蜜拉與菠蘿蜜的比較中發現，76份菠蘿蜜種質與尖蜜拉的遺傳相似系數在0.502～0.731，說明菠蘿蜜種質與尖蜜拉種質之間有較近的親緣關系，這與Schnell等、Kanzaki等的研究結果相同。另外。研究發現來源于廣東湛江的尖蜜拉種質與菠蘿蜜種質有較高的親緣關系，這可能與所研究菠蘿蜜種質主要采樣來源于雷州半島和參與研究的尖蜜拉種質只有2份有關。

3.3 干包和濕包種質間的差異比較

長期以來。人們按肉質脆軟和水分多少將我國菠蘿蜜分為干苞和濕苞2種類型，國外的分類與我國類似，基本上也分為2類：軟肉型(Softflesh，softjackfruits)和脆肉型(Firmflesh，hardjackfruits)。本研究用ISSR分析的結果與前人利用其他分子標記方法得到了相同的結果，均不能把干包和濕包區分開來。這可能與所用引物有限，沒有擴增出干、濕包的特異位點有關。李映志等認為菠蘿蜜濕包類型和干包類型的分類不應是在種一級的植物學分類水平，而只能作為品種的分類水平，2者的差別并不是遺傳背景上的迥然差異，這與分子標記的結果相吻合。筆者認為對于濕包類型和干包類型的分類，用少數的形態性狀來劃分比較適合，支持前人的分類標準；但對濕包類型和干包類型的親緣關系進行分析時應該通過多個性狀和多種方法(形態和分子方面)結合來研究，這更有利于菠蘿蜜種質資源的開發和優良品種的選育。

4 結論

利用ISSR標記方法對76份菠蘿蜜種質資源DNA的遺傳多樣性進行了檢測，24個引物共檢測到477條帶，且把76份種質完全區分開來。遺傳距離分析結果顯示供試種質的遺傳多樣性較低，在DNA水平上的遺傳相似系數在0.626～0.945，平均為0.775。表明東南亞地區菠蘿蜜種質的親緣關系較近。UPGMA聚類分析表明，76份菠蘿蜜材料在遺傳距離系數為0.752處可分為4大類，其中海南興隆熱帶植物園的種質WJ2和GSYWJ1與其他種質的遺傳距離相對較大，干胞和濕胞類型不能獨立聚類。另外各地區的種質與雷州半島種質明顯分開聚類。而雷州半島各地區的種質混雜聚類在一起，不能按地區單獨聚類。