枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害的研究進(jìn)展

摘要：果實(shí)采后病害嚴(yán)重影響水果的貯藏及果品質(zhì)量。因化學(xué)殺菌劑在應(yīng)用中存在危害人體健康及污染環(huán)境等一系列問題，利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)防治果實(shí)采后病害的生物防治手段作為一種有效替代方法受到人們的廣泛關(guān)注。枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌研究的模式菌株，為重要的生防菌源。在探討枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害拮抗機(jī)制的基礎(chǔ)上，闡述了該領(lǐng)域的研究成果和最新進(jìn)展，展示了枯草芽孢桿菌應(yīng)用于果實(shí)采后病害生物防治的可行性和潛力，為今后果實(shí)采后生防產(chǎn)品的開發(fā)提供新的研究思路。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；采后病害；生物防治；作用機(jī)理

中圖分類號：S66

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009—9980 (2009)05—699—05

一直以來，受果蔬產(chǎn)品貯藏和運(yùn)輸周期所限制，新鮮水果采后損失現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。新鮮水果的品質(zhì)惡化主要由病原菌引發(fā)，控制新鮮水果的采后病害往往是科研工作者的關(guān)注焦點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，發(fā)達(dá)國家每年有10％～30％的新鮮水果損失于采后的腐爛，而在缺乏冷藏貯運(yùn)設(shè)施的發(fā)展中國家，果實(shí)腐爛損失率則超過40％。引起果實(shí)采后腐爛的病原菌大多為真菌，長期以來防治真菌病害主要是采用化學(xué)殺菌劑，然而，由于病原菌的抗藥性、果品質(zhì)量安全以及人們對環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，發(fā)展無公害型生物農(nóng)藥來控制果實(shí)采后病害成為一種新趨勢，逐漸成為研究熱點(diǎn)。自Gutter等首次證實(shí)枯草芽孢桿菌能夠拮抗柑橘果實(shí)病原菌的半個(gè)世紀(jì)以來，枯草芽孢桿菌作為一種有效的生防菌劑被廣泛應(yīng)用于多種植物病原真菌的防治中。作者就近年來國內(nèi)外關(guān)于枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害的研究情況進(jìn)行綜述。以期為今后進(jìn)一步促進(jìn)果實(shí)采后病害生物防治技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 枯草芽孢桿菌概述

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)為芽孢桿菌科(Bacillaceae)芽孢桿菌屬(BacillusCohn)中最具代表性的菌種，長期以來受到國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注，這種內(nèi)生芽孢的桿狀細(xì)菌也是研究革蘭氏陽性(Gram-positive，G⁺)細(xì)菌細(xì)胞生物學(xué)的模式菌株。枯草芽孢桿菌(B，subtilis)生理特征豐富多樣，在自然界中分布廣泛，該菌不僅可以在土壤、植物根際、體表等外界環(huán)境中生長，還是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌。這類細(xì)菌對人畜無毒無害。不污染環(huán)境，已廣泛應(yīng)用于果實(shí)采后病害的生物防治研究中，屬于安全有益的微生物。譚志瓊等和王星云等先后證實(shí)枯草芽孢桿菌B68能夠通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)有效控制香蕉果實(shí)炭疽菌及冠腐病菌的生長。趙白鴿等經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)枯草芽孢桿菌B-903對蘋果輪紋菌具有明顯抑制效果，并有希望取代相當(dāng)部分的化學(xué)農(nóng)藥用于果樹病害防治。在南非部分地區(qū)，研究人員先后報(bào)道了枯草芽孢桿菌防治鱷梨采后病害的抗病機(jī)制，并將其活菌制劑噴灑于田間來防治鱷梨采后病害。利用廣譜抗生型枯草芽孢桿菌PRS5處理采后的蘋果和臍橙。可以達(dá)到良好防腐效果，相對防效分別高達(dá)86.7％和95.15％。辛玉成等通過室內(nèi)及田間試驗(yàn)證實(shí)了枯草芽孢桿菌XMl6菌株制劑和培養(yǎng)液均能有效控制蘋果霉心病的發(fā)生和危害。

鑒于枯草芽孢桿菌在果實(shí)采后病害防治方面的優(yōu)勢，眾多的專家學(xué)者圍繞其拮抗機(jī)制展開了研究。

2 枯草芽孢桿菌作為生防因子的作用機(jī)理

關(guān)于拮抗型枯草芽孢桿菌的防病機(jī)制，近些年國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為其與病原菌間的作用方式主要包括拮抗作用、競爭作用和誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性等3方面。

2.1 拮抗作用

拮抗作用是指生防微生物通過同化作用產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來抑制有害病原物的生長，這也是生防細(xì)菌防治果實(shí)采后病害的主要機(jī)制。芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有抗生素、細(xì)菌素、細(xì)胞壁降解酶類和其他抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)。其中，產(chǎn)生抗生素是枯草芽孢桿菌抗菌作用的一個(gè)重要因素。自1945年Johnson等報(bào)道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)后，近半個(gè)多世紀(jì)以來，人們從枯草芽孢桿菌的不同菌株中發(fā)現(xiàn)了60多種抗生素。范青等分別報(bào)道了枯草芽孢桿菌B-912對桃和油桃褐腐病以及采后柑橘果實(shí)青、綠霉病的抑制效果，認(rèn)為枯草芽孢桿菌的抑菌機(jī)理主要是通過產(chǎn)生抗菌素來抑制病菌的生長。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素主要有表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(Iturins)和芬薺素(Fengycin)3大類。張靜等研究證實(shí)。從枯草芽孢桿菌PY-1發(fā)酵液中分離純化的伊枯草菌素A是PY-1有效防治柑橘采后綠霉病的主要抗菌物質(zhì)。在防治采后蘋果炭疽病的研究中，檀根甲等證實(shí)了枯草芽孢桿菌B-24可以通過產(chǎn)生抗菌素發(fā)揮抑菌作用。Ongena等以B.subtilisM4為試材，研究該菌抑制蘋果采后灰霉病的抗性機(jī)理，認(rèn)為M4主要是通過分泌脂肽類抗生索(Lipopeptides)，尤其是Fengycins來防治果實(shí)采后病害。齊東梅等研究證實(shí)了具廣譜拮抗作用的枯草芽孢桿菌H110主要通過分泌胞外抗菌蛋白來抑制蘋果梨采后青霉病和黑斑病的發(fā)生。枯草芽孢桿菌分泌的抗菌蛋白對多種病原真菌均具有明顯抑制作用，其抗病機(jī)制涉及抑制病原菌孢子產(chǎn)生和萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲畸形，細(xì)胞壁溶解，原生質(zhì)泄漏以至菌絲體崩潰等方面。

2.2 競爭作用

營養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競爭作用是生防微生物發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。一般來說。病原菌主要是通過侵入果實(shí)表面的自然通道(皮孔、氣孔等)或機(jī)械傷口而引起果實(shí)采后病害發(fā)生。在防治鱷梨炭疽病的研究中，枯草芽孢桿菌可以通過在病原菌膠孢炭疽菌(Collectotrichumgleosporioides)附著孢周圍消耗營養(yǎng)，從而使病菌處于休眠狀態(tài)。齊東梅等在研究枯草芽孢桿菌H110防治蘋果梨采后病害過程中還發(fā)現(xiàn)，H11O除了通過產(chǎn)生抗菌蛋白實(shí)現(xiàn)抗菌目的外，還可能通過營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭來抑制病原菌生長。另有研究認(rèn)為，枯草芽孢桿菌QDH-1-1在防治采后蘋果青霉病的過程中，并不產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，主要是通過營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭來控制病原菌的侵染，枯草芽孢桿菌B1O也是通過活菌液的營養(yǎng)競爭作用有效抑制灰霉病菌生長。由此作為草莓灰霉病的生防菌用于草莓采后的防腐保鮮。以往的研究證實(shí)，多數(shù)枯草芽孢桿菌的競爭作用只涉及生防細(xì)菌的種群數(shù)量和防效的相互關(guān)系，直接的遺傳證據(jù)和分子生物學(xué)研究不多見。

2.3 誘導(dǎo)抗性

采后果實(shí)抗病反應(yīng)包括本身固有的抗病作用和誘導(dǎo)抗病2種方式。本身已有的抗病反應(yīng)是由一些障礙物或已存在的生化反應(yīng)來完成，包括組織木質(zhì)化、產(chǎn)生植保素、以及過程中所涉及各種酶(PAL、PO、SOD、PPO等)的活性反應(yīng)；誘導(dǎo)抗病反應(yīng)因涉及果實(shí)對病原菌的識別、信號傳導(dǎo)以及相應(yīng)基因表達(dá)等，非常復(fù)雜。當(dāng)前，利用誘導(dǎo)抗性防治果實(shí)采后病害已開始為國內(nèi)外研究人員所關(guān)注。應(yīng)用研究表明，植物包括采后果實(shí)，預(yù)先經(jīng)過一些生物型或非生物型誘導(dǎo)因子處理后，可產(chǎn)生抗病性，從而降低其發(fā)病率。作為一種生物型誘導(dǎo)因子，枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性作用的報(bào)道相對較少，但已經(jīng)證明誘導(dǎo)植物抗性也是其生防作用的重要機(jī)制之一。

值得注意的是，枯草芽孢桿菌制劑抗生物質(zhì)的作用，是整個(gè)菌體代謝物的綜合作用，而不是傳統(tǒng)應(yīng)用中單一抗生物質(zhì)的作用。

3 應(yīng)用現(xiàn)狀

枯草芽孢桿菌具備多種優(yōu)良特性以用于生防菌劑的研究開發(fā)與推廣應(yīng)用，包括其在離體條件下可產(chǎn)生抗生素類、酶類和揮發(fā)性成分，可產(chǎn)生抗逆的芽孢，利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖等。自Pusey等首次將枯草芽孢桿菌(B－3)菌系作為控制桃果實(shí)采后病害的生防制劑在美國取得專利后。枯草芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于果實(shí)采后病害防治上，其中一些枯草芽孢桿菌工程菌株也被成功改良開發(fā)為商業(yè)生防菌劑，并進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。大量實(shí)踐證明，枯草芽孢桿菌制劑的穩(wěn)定性、與其他化學(xué)試劑的相容性和在不同果蔬不同年份防效的一致性等方面均明顯優(yōu)于非芽孢桿菌和真菌生防菌劑。美國迄今已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。它們是GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種(B，subtilisvar，amyloliquefaciensFZB24)。其中的生物殺菌劑QST713為AgraQuest公司產(chǎn)品，商品名為Serenade，主要用于防治水果采收前后病害。

我國利用芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也有一定基礎(chǔ)，在田間病害生物防治研究中已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的商品化制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等，但應(yīng)用于果實(shí)采后防腐保鮮方面的枯草芽孢桿菌商品制劑并不多見。林開春等公布的含有枯草芽孢桿菌CCTCCM204085的防腐保鮮劑(公開號：1853489)在果實(shí)采后防腐保鮮方面的應(yīng)用效果較好。楊佐忠等利用枯草芽孢桿菌PRS5處理采后的蘋果和臍橙，也達(dá)到了較好的防腐保鮮效果。

4 展望

隨著我國水果種植業(yè)的迅猛發(fā)展，果實(shí)采后防腐保鮮工作得到愈來愈多的重視，安全高效的生物防治手段也為廣大研究者所關(guān)注。實(shí)踐證明，相對于大田作物的生防措施，果實(shí)采后病害的生物防治具備獨(dú)特優(yōu)勢，包括果實(shí)貯藏期的溫濕度可控制且穩(wěn)定、浸果或噴霧方法可使拮抗菌準(zhǔn)確進(jìn)入作用位點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室易于模擬果實(shí)貯藏條件，便于相關(guān)試驗(yàn)的開展。此外，相對于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的水果產(chǎn)品，應(yīng)用復(fù)雜的生防措施及較高的防治費(fèi)用也易被接受。近年來，世界各國均在研究果實(shí)采后病害生物防治措施，包括適應(yīng)果實(shí)采后系統(tǒng)的新途徑和方法。

現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展極大地影響了微生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究，隨著枯草芽孢桿菌全基因組序列測序工作的完成以及生物質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用。枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究實(shí)現(xiàn)了真正意義上的突破。迄今為止，關(guān)于枯草芽孢桿菌防治水果采后病害相關(guān)分子機(jī)制方面的研究報(bào)道極少，應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究和確定病原菌誘導(dǎo)前后特異表達(dá)的功能蛋白，將為系統(tǒng)闡明枯草芽孢桿菌的抗病機(jī)制提供重要參考。

隨著人們環(huán)保意識的加強(qiáng)、生物防治理論的不斷深入以及現(xiàn)代生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害的研究開發(fā)展現(xiàn)出新的發(fā)展機(jī)遇，利用拮抗型枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害的生防技術(shù)將日趨完善。