不同山楂品種親緣關系的ＲＡＰＤ分析

摘要：為探討山楂品種間的親緣關系，采用RAPD技術對20個不同品種的山楂材料進行了基因組DNA多態性分析。從120個引物中篩選出15個10bp的隨機引物對所選山楂品種的DNA樣品進行PCR擴增，共得到216條譜帶，177條表現多態性，多態性比率達81.9％，其中包含27條特異性譜帶，揭示了山植植物豐富的遺傳多樣性。且利用NTSYS軟件和UPGMA法對擴增結果進行了品種間相似系數的計算及聚類分析，結果表明相似系數在0.71～0.87，實生楂與其他山楂品種親緣關系較遠。

關鍵詞：山楂；親緣關系；RAPD

中圖分類號：S661.5

文獻標識碼：A

文章編號：1009—9980(2009)05—729—4

山楂(CrataegusL.)屬薔薇科蘋果亞科植物，是起源于我國的特產果樹。山楂品種資源豐富，經過長期栽培和選擇形成了豐富的變異類型。由于某些山楂品種的形態學性狀很相似，所以同名異物和同物異名現象十分普遍。我國山楂資源研究至今多是通過常規方法對其進行評價鑒定，關于分子水平的研究報道不是很多。山東地區山楂資源豐富，在分子水平針對山東山楂的研究尚未見報道。郭太君等利用過氧化物同工酶酶譜將山楂分為大山楂、伏山楂、秋山楂、軟籽山楂和黃果山楂5個品種群，并對伏山楂和黃果山楂植物分類地位以及品種群間的親緣關系進行了探討。

Welsh等和Williams等利用PCR技術發展起來RAPD技術，RAPD具有技術簡單、檢測速度快、只需少量DNA樣品、不依賴于種屬特異性和基因組結構、一套引物可用于不同生物基因組分析和成本較低等優點，在桃、櫻桃、蘋果、杏、梨、葡萄等多種果樹中得到廣泛應用。但是，RAPD技術應用于山楂的研究還極少。代紅艷等對5個野生類型和30個大果類山楂栽培變種進行了RAPD分析，指出野生類型與栽培品種間的親緣關系較遠。同時也證明了RAPD技術應用于山楂品種間的親緣關系是可行的。我們選取了山東省臨沂市的20個品種進行了RAPD-PCR分析，并構建了遺傳樹狀圖對山楂不同品種間的親緣關系進行了研究，旨在豐富該組植物系統學研究內容，為我國山楂種質資源的分子生物學方面的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

采集20份山楂材料嫩葉(表1)，時間為2008-年4月初，地點是山東省臨沂市，將樣品貯于80℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 總DNA提取與測定

取各品種嫩葉，采用CTAB法提取總DNA，考慮到多年生果樹富含多糖和酚類物質的特性，在提取緩沖液中加入3％的PVP和2％的B－巰基乙醇。采用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，測定DNA在260nm和280nm下的吸光值確定其純度，于-20℃冰柜中保存備用。

1.3 引物篩選

參照北京賽百盛SBS公司的引物序列，選取120個引物對少數山楂品種的DNA樣品擴增。從中篩選出擴增性強、重復性好、多態性高的15個引物(表2)，用于全部山楂品種DNA樣品的擴增。

1.4 PCR擴增及產物的鑒定

由于RAPD反應條件在物種間的較大差異性。本試驗摸索了一套專門適合山楂PCR擴增的程序。PCR的反應體系如下，20μL總體積中含不少于50ngDNA模板，引物(10mmol·L^-1)1.6μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，10×Taqbuffer(含MgCl₂)2μL，TaqDNA聚合酶(2.5U·μL^-1)0.5μL，ddH₂O13.4μL。擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性45s、34℃退火45s、72℃延伸1min，40個循環，最后72℃延伸5min。PCR擴增反應結束后，在1.4％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。并且實驗用dNTP、10×Taqbuffer、TaqDNA聚合酶均購自TIANGEN公司，實驗用品的統一性確保了擴增的穩定性。

1.5 數據統計與分析

電泳圖譜中的每一條帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結合位點，可記為一個分子標記，并估計擴增產物的分子量大小。將有帶的記為1，無帶的記為0，形成0、1矩陣圖輸入計算機。采用NTSYS-pc2.10e軟件分析了不同山楂品種的RAPD擴增數據，得到品種間的相似度系數矩陣。根據UPGMA方法構建聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA多態性分析

表2列出了不同引物的堿基序列及其對不同山楂品種擴增反應的結果。從120個隨機引物中選出15個引物對20個山楂品種的DNA樣本進行PCR擴增，結果表明擴增的產物譜帶從9條(AS7)到23條(A4)不等，平均每個引物產生14條帶，共產生216條擴增產物帶，其中177條具有多態性，比例達81.9％，充分體現了該組植物豐富的遺傳多樣性。擴增產物的大小從120bp至2300bp不等，說明該組植物具有豐富的多態性。引物ASl3對20個山楂品種DNA的PCR擴增結果見圖1。

2.2 各個分類群聚類分析采用UPCMA法構建遺傳聚類樹狀圖(圖2)，相似系數為0.71～0.87。在相似系數0.76處，毛紅香和實生楂分別獨立出來，其余可以歸為2大類。Ⅰ聚類組中包括3部分。第1部分有早面紅、大棉球和歪把紅。第2部分有橙紅甜、青條紅、小白條和五星紅，第3部分有紫肉楂、甜紅和白條紅。Ⅱ聚類組中，大金星(北王)、天寶紅、小金星、沂楂紅和花葉楂5個品種關系較近，而山里紅和冠金星相近，小甜紅最先獨立出來。

20個山楂品種DNA的PCR擴增結果表明(表2)，其擴增片段的數量多，特別是特異性擴增譜帶多達27個，材料間都有不同的遺傳距離，這充分顯示了山楂物種有豐富的遺傳多樣性。在聚類樹狀圖中，早面紅、大棉球、歪把紅聚在一起，表明其親緣關系較近，從品種生物學特性上也能反映這一點。如3個品種的果實較大。果肉軟綿，與親緣關系較遠的實生楂相比，后者的果實小而硬，枝刺較多，表現出較強的野生性狀：而與毛紅香山楂相比，毛紅香的果實、葉片及其枝條都布有較多茸毛，其生物學性狀有較大差別。

2.3 特異性DNA分子標記分析

統計結果表明，20個山楂品種中有12個產生了特異性的遺傳標記。如：橙紅甜、紫肉楂、白條紅、小金星、毛紅香、大金星、青條紅、花葉楂、山里紅、冠金星、實生楂和小白條。而這些品種皆有與其他品種間區別的生物學特性，如橙紅甜的果實含糖量最高，紫肉楂的果皮和果肉均呈紫紅色，花葉楂的枝條多刺且葉子有花狀斑點等。

對20個引物的RAPD電泳圖譜分析發現，27個特異性條帶中實生楂含5條。分別為AS7擴增的1200bp，Al擴增的1800bp、950bp和800bp，與A4擴增的1350bp。毛紅香也有5條特異性譜帶，分別為A1擴增的2100bp帶、A4擴增的2100bp和200bp帶、A18擴增的1800bp帶和A20擴增的2300bp帶。聚類分析結果也表明實生楂、毛紅香與其他種類的遺傳距離最遠。在相似系數0.76處最先獨立出來。山里紅在800bp、550bp和1200bp也存在3條特異性譜帶。此外。紫肉楂、白條紅、青條紅、冠金星等也存在不同的特異性譜帶，但是并非所有的品種都有這種現象。

3 討論

雖然RAPD分子標記技術應用已很廣泛，但是國內外將此技術應用于山楂遺傳關系研究的極少。本研究的試驗材料均采自山東臨沂市，并且在試驗方法上與代紅艷等有所不同，比如在DNA提取中加入PVP和B—巰基乙醇，以更好地去除多糖和酚類物質；在反應體系上，本實驗采用的RAPD-PCR擴增的溫度、時間和引物的選擇上也有差別。并且本實驗用試劑均來源于同一生物公司，保證了擴增結果的穩定性。僅用15個引物，在20個山楂品種中擴增出216個多態性譜帶，多態性比例高達81.9％。證明了利用RAPD分析完全能反映出山楂品種間的遺傳多樣性，可以作為山楂種質分類鑒定的依據。

本實驗雖然所用引物數量不多。但能從216個位點對20個山楂品種進行分子檢測，而且這種檢測效率比常規的生物學和細胞學特征等方法更為可靠。本研究中多數山楂品種間表現出了豐富的遺傳多樣性，并且12個品種還有特異性DNA分子標記，這些特異性條帶可能是某些優良性狀基因，對于山楂品種間分子鑒定具有重要的參考價值，進一步研究可以用于新品種的選育。

從聚類分析圖中可以看出，Ⅰ聚類組中第1部分有早面紅和大棉球，2者有較相似的生物學特性。果實較大且成熟早，果肉軟綿，果面布有果粉。野生品種花葉楂和山里紅同在Ⅱ聚類組中。這一研究和代紅艷等分析的結果相近。實生楂果實小而硬，枝刺較多。表現出較強的野生性狀可能屬于郭太君等提出的伏山楂品種群，其他的則為大果類山楂品種群，因此實生楂與其他山楂品種親緣關系較遠。