腦卒中與一氧化氮合成酶基因相關性及預防措施的研究

關于腦卒中基因水平的研究近年已經受到廣泛的關注，人eNOS第7外顯子C894T突變使編碼的第298位谷氨酸(Glu)被天冬氨酸(Asp)所取代，使eNOS發生構象改變，從而引起eNOS活性降低，NO生成減少，從而減少了對腦血流的調節和神經細胞的保護作用，促進了腦卒中的發生。

我們采用候選基因病例對照的方法，以中國漢族腦卒中的患者，與年齡、性別相匹配的無腦卒中的高血壓患者和健康人為研究對象，研究eNOS基因與腦卒中的相關性，旨在尋找預防腦卒中的措施，從分子水平提示腦卒中的發病機理，及早發現腦卒中的致病基因，為腦卒中的遺傳學發病基礎研究及早期預警提供線索，避免腦卒中發病造成的死亡和重度致殘。

資料與方法

研究對象與分組：臨床共觀察腦卒中病人300例，與腦卒中患者年齡性別匹配的健康人300例。漢族，無血緣關系。其中男190例(占63.33％)，女110例(占36.67％)，男女比例為1.60：1；病例組平均年齡為61.34，對照組的平均年齡61.03，差異無統計學意義(P=0.698)。而腰臀比、體質指數及有無高血壓、糖尿病、冠心病及吸煙史等方面，具有統計學意義。

病例排除標準：排除癡呆、癲癇、腎功能不全(血清肌酐＞132mnoL／l及≥2mg／dl，和／或蛋白尿血尿)及肝功能不全(ALT≥正常上限的2倍，或有肝性腦病、肝硬化、食道靜脈曲張或門靜脈分流史)，甲狀腺功能亢進或低下，慢性阻塞性肺病。有惡性腫瘤史(包括白血病或淋巴瘤)，有自身免疫性疾病。病人不同意參加本研究者。

研究方法：①病例組：詢問高血壓病史、吸煙、飲酒史。進行CT或MIR檢查。抽血檢查血尿常規、肝、腎功能、血脂檢查。②對照組：同上。 兩組抽取靜脈血5～6ml進行分子生物學試驗，步驟如下：從白細胞中提取DNA(采用酚-氯仿法)。①進行DNA鑒定、定量。②用PCR擴增eNOS基因。③PCR擴增產物進行酶切(RFLP)。④對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳。⑤顯示電泳條帶。⑥選擇不同基因型的PCR產物各3個標本DNA片段純化吸收。對PCR產物進行克隆。并進行DNA測序。

觀測指標：①eNOS基因型及等位基因在腦卒中組和對照組中的分布。②eNOS基因型與腦卒中關系。③eNOS基因型、WHR、BMI、高血壓病史、吸煙、飲酒、體育鍛煉等是否具有協同效應。

統計學方法：采用X²檢驗和t檢驗比較腦卒中組與健康人組。X²檢驗對基因Hardy-Weinberg平衡檢驗。計算OR值。采用Logistic多元回歸分析基因多態性及其他危險因素對腦卒中的作用。同時應用X²檢驗比較環境因素(吸煙)與基因之間是否存在交互作用。所有統計學處理應用SPSS8.0軟件進行處理。

結果

基因型分布：病例組：等位基因G的頻率87.75％，等位基因T的頻率12.25％；對照組：等位基因G的頻率90.89％，等位基因T的頻率9.11％。OR值為1.570，P為0.016，T等位基因頻率腦卒中組顯著于對照組。

同時可見以GG基因型為參照，分析TT、GT和GT+TT基因型與腦卒中發病的關系，可見攜帶至少一個T等位基因的基因型個體患腦卒中的風險為攜帶GG基因型者的1.524倍。以多元逐步條件logistic回歸分析，調整吸煙、飲酒、體制指數、腰臀比、高血壓病史等因素的影響后，eNOS Gg94T變異對腦卒中仍具有影響，OR為2.165。

討論

腦卒中已成為人類的主要“殺手”之一。我國腦卒中每年新發生病例約150萬，其中80％是缺血性腦卒中，嚴重影響人民的生命和生活質量。因此，從分子水平深入研究腦卒中的發病機制具有重要意義。一氧化氮(NO)主要由內皮型(eNOS)調節，其在抗動脈粥樣硬化及腦血流調節中起關鍵性作用，并最終影響梗死面積。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸生成NO和瓜氨酸。內皮細胞生成的NO可促進血管平滑肌細胞舒張，抑制血管內皮表面血小板和白細胞的粘附與聚集，防止低密度脂蛋白氧化。抑制血管平滑肌細胞增生，對血管收縮因子如內皮素及血管緊張素具有抑制作用，因此是血管AS過程重要的抑制因子。

迄今為止已有大量的研究探討了eNOS基因多態性與冠心病、腦卒中的關系，但所得結論不一。人eNOS含有1203個氨基酸，其基因為單拷貝，定位于染色體7q352q36，全長21-22kb，包括26個外顯子和25個內含子。第7外顯子G894T突變使編碼的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天門冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS發生構象改變，從而引起eNO s活性降低，NO生成減少。

Elbaz等對法國12個中心460例腦卒中患者及460例年齡、性別相匹配的健康對照者研究后發現，eNO s Glu298A spT等位基因純合子與腦梗死，尤其腔隙性梗死有關，并認為該基因遺傳易感性與LDL 2eh存在協同作用。

結果表明：eNOS基因C894T變異基因型在腦卒中和對照組中分布差異有統計學意義，T等位基因頻率腦卒中組顯著對照組，OR為1.570。同時單因素條件logistic回歸分析顯示攜帶至少1個T等位基因的基因型個體患腦卒中的風險為攜帶GG基因型者的1.524倍。在0.05顯著性水平下，以多元逐步條件logistic回歸分析，調整吸煙、飲酒、體制指數、腰臀比、高血壓病史等因素的影響后，eNOS G894T變異對腦卒中仍具有影響，OR為2.165，是腦卒中的重要的危險因素。

但腦卒中是多基因、多因素疾病，是遺傳和環境因素互相作用所致。目前已知的與其發病相關的基因大部分是單基因研究得出的結論，且國內外都存在結論不一致的報道，究其原因可能包括：①樣本量、實驗設計、技術和統計學的方法不盡相同；②對病例和對照的選擇不同；③各研究樣本的種族、地區分布不一；④腦卒中的分類診斷標準不同。為進一步有效篩選腦卒中的候選基因，需要更多的大樣本的臨床研究和開展遺傳流行病學、分子流行病學研究及綜合考慮多因素，對基因一基因及基因一環境相互作用進行深入研究，以便弄清腦卒中的發病機制及探索新的防治措施。