生物農藥固態發酵綜述

陳建幫 弓愛君 李紅梅 邱麗娜 曹艷秋 校 逸

摘要:從生物農藥固態發酵中的發酵原料、條件控制、發酵設備、毒力檢測等方面對生物農藥的固態發酵研究進行了綜述。

關鍵詞:固態發酵;生物農藥;蘇云金芽孢桿菌

中圖分類號:TQ45文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.018

Review on Solid State Fermentation of Bio-pesticide

CHEN Jian-bang1,GONG Ai-jun1,LI Hong-mei2,QIU Li-na1,CAO Yan-qiu1,XIAO Yi1

(1. Beijing University of Science and Technology,Beijing 100083,China;2.China National Measuring Science Research Institute,Beijing 100013,China)

Abstract:In this paper, current developments of solid state fermentation of bio-pesticide, including raw materials, conditions control, bioreactors and toxicity assays were reviewed.

Key words:solid state fermentation;bio-pesticide;Bacillus thuringiensis

生物農藥一般是指自然界中存在的生物活體,如細菌、真菌、病毒等微生物或其產生的具有防治農業病蟲、草、鼠害作用的生物活性物質。在農業生產中使用生物農藥替代化學農藥,可以達到不污染環境、對人畜安全、防治對象不易產生抗藥性、不殺傷天敵、對生態鏈的影響小等目的。隨著生態農業和有機農產品市場的不斷發展,生物農藥受到了越來越多的重視,并顯示出了強勁的發展勢頭[1,2]。

近年來,固態發酵工藝在生物農藥工業生產中的應用取得了進展。固態發酵是沒有或只有少量游離水存在,在具有可以滿足微生物生長代謝的一定濕度的固態營養基質中進行的微生物發酵過程[3]。和傳統的深層液體發酵工藝相比,固態發酵具有培養基含水量低,所需反應器體積小,產物濃度高,產品純化費用低,無廢水排放,污染物較少(屬于清潔生產技術),所需通氣壓力低、能耗少,培養基來源廣泛等優越性[4],特別適合于發展中國家生物農藥的有效生產[5,6]。利用固態發酵生產的生物農藥品種主要有細菌類殺蟲劑,如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis),真菌類殺蟲劑白僵菌(Beauveria bassiana)、盾殼霉(Coniothyrium minitans)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)等。其中蘇云金芽孢桿菌經過百年的發展已成為目前世界上產量最大、應用最廣的生物殺蟲劑[7]。

1生物農藥固態發酵原料

固態發酵基質為微生物提供發酵所需的營養并且作為微生物細胞生長的載體。對微生物固態發酵過程中傳質、傳熱和微生物的代謝過程產生影響[8]。固態發酵基質發酵原料的選擇不僅關系到發酵水平,而且和生產成本密切相關。目前生物農藥固態發酵原料主要是工農業產品加工后的副產品及其廢棄物。這些原料來源廣泛、豐富,可以實現這些廢棄物的的資源化利用,又可以降低生物農藥生產成本。

常用的發酵原料包括麥麩、米糠、黃豆粉餅、花生粉餅等。陳欣等[9]以麩皮為唯一固態發酵底物對盾殼霉的孢子生產進行了研究,通過對不同麩皮和小麥配比的底物的發酵結果進行比較,確定了利用麩皮作為唯一底物進行盾殼霉固態發酵可以達到較好的效果。陳欣等[10]還對以麩皮作為盾殼霉孢子固態發酵基質添加營養液的固態發酵進行了培養基優化。Vimala Devi等[11]利用麥麩為主要原料,添加糖蜜和酵母浸膏作為補充碳源和氮源進行蘇云金芽孢桿菌的固態發酵研究,確定了一種便宜有效的蘇云金芽孢桿菌生產方式。孫翠霞等[12]采用正交試驗對蘇云金芽孢桿菌的固態發酵培養基進行了優化,確定了固態培養基中麥麩、豆餅粉、玉米粉、酵母粉、米糠和無機鹽的最佳比例。

雖然麩皮、米糠等一直作為生物農藥固態發酵常用原料,但是由于他們可以作為動物飼料和人類膳食纖維素的主要來源及其高溫滅菌后存在粘度增加、疏松度不夠、空隙小、后續接種困難等缺點,研究人員一直致力于尋找新的固態發酵基質。

張怡等[13]嘗試以廢次煙草為固態發酵原料,用于蘇云金芽孢桿菌的固態發酵,實現了廢次煙草的綜合利用,獲得了質量優良的生物殺蟲劑。Adams等[14]研究利用肉雞產生的垃圾進行固態發酵生產蘇云金芽孢桿菌。陶玉貴等[15]以啤酒糟為主要原料,并添加了適當的玉米粉、豆粕和無機鹽進行了蘇云金芽孢桿菌的固態發酵研究。楊超英等[16]用響應面分析法對以啤酒糟為主要基質的蘇云金芽孢桿菌培養基進行了優化?；谑程檬ｏ埐藖碓吹膹V泛性及其中含有豐富的粗纖維、淀粉、粗蛋白及各種營養元素,弓愛君以食堂剩飯菜為發酵原料進行固態發酵,生產出了具有市場競爭力的蘇云金芽孢桿菌生物農藥。

2發酵條件控制

在固態發酵的過程中如何成功控制水活度、溫度、pH值、通氣與傳質等影響參數是制約固態發酵技術規?；瘧玫闹匾獑栴}[17]。

2.1水活度

水是微生物生長所必不可少的營養物質,是發酵的主要媒介。在固態發酵中,由于沒有游離水存在,所以基質水活度αw必然會對微生物的生長和代謝能力產生重要影響。基質水活度αw與含水量有關。發酵基質中若含水量過大,則芽孢、晶體游離晚,發酵周期延長;含水量過低,菌體吸收不到培養基中各種營養和水分,也會使發酵受抑制[18]。在發酵過程中,基質水活度αw會隨著蒸發及微生物代謝活動的進行而逐漸降低,使得發酵難以正常進行。在大規模固態發酵過程中通常使用蒸發冷卻來進行溫度控制,也會造成較大的水分損失,使得固態培養基需要進行水分補充[19]。通過連續通濕空氣、安裝增濕器或隔一段時間往底物中添加無菌水的方法可以使αw維持在微生物生長所需要的最適值[20]。

2.2溫度

固態發酵基質多為有機質,導熱性能差,沒有自由流動的液相。隨著發酵的進行,發酵底物空隙率降低,使得發酵過程中產生的代謝熱難以及時擴散開來,形成溫度梯度,甚至使得溫度急劇上升,大大高于菌種固態發酵的適宜溫度,從而影響固態發酵的發酵水平[21]。吳振強等[22]在對金龜子綠僵菌的固態發酵進行環境變量優化研究時發現溫度可以對金龜子綠僵菌的菌絲生長和產孢量產生影響,當溫度由適宜溫度升高到接近高限生長溫度時,將引起可逆性的生長率下降甚至抑制。采用熱電偶傳感器可以監測物料的溫度和溫度變化梯度[20]。在實驗室規模反應器中,可以將反應器放置在溫度可控的環境中(例如水浴中)進行控溫[23]。在大規模固態發酵系統中,主要采用將通氣、溫度、濕度控制相耦合的方式作為主要的控溫措施。利用干燥的無菌空氣對固體培養基進行強制通風可以加快熱量從固體培養基表面到氣相的傳遞速率,帶走大量的代謝熱量。同時為了防止固態培養基干燥,定期對培養基噴入無菌水,以維持固體培養基的含水量[8]。

2.3pH值

pH值是固態發酵過程中的關鍵因素。微生物發酵有其最適合和能夠耐受的pH值范圍。許多固態發酵過程的pH值具有特征性的變化,只是在固態發酵過程中缺乏在線測量濕潤物料pH值的有效方法,使得pH值難以控制。目前多采用的是在固態發酵時調節好培養基的初始pH值,選用具有較大緩沖能力的固態物料來進行發酵,發酵過程中通常不進行pH值的檢測和控制[24]。其他措施還有在培養基中添加緩沖液,用脲取代銨鹽作為主要的氮源來抵消發酵過程中生成的酸帶來的負面影響。陶玉貴[25]根據固體培養基難以調節pH值的特點,利用緩沖溶液對固體培養基用水進行pH值不同程度的調整,來研究培養基初始pH值對蘇云金芽孢桿菌毒力效價的影響,得到蘇云金芽孢桿菌固態發酵最適pH值為7.5。

2.4通氣與傳質

通氣有助于氧氣從氣相傳遞到固態基質表面上的微生物,同時也可以起到轉移代謝熱和二氧化碳的作用。通氣的速率和多少取決于微生物的特性、合成產物對氧的需求程度、發酵反應產生的熱量多少、底物的料層厚度、微生物產生的二氧化碳和其它易揮發代謝產物的量和底物間的有效空隙。定時完全換氣或改變氣體流向是控制固態發酵中氣體的常用方法。通氣量過大會減少基質的水分,降低基質水活度,使得固態基質需要進行水分補充。利用氣相色譜分析儀器分析發酵器頂部空間的氣體或用氧分析儀測定需氧量和吸收率可以對通氣量進行監測,以便控制通氣量。

固態發酵的傳質過程包括空氣進入和排出反應器的過程;無通風情況下空氣自然流動引起的自然對流、擴散過程;在生物反應器壁和周圍環境之間發生的傳質過程;攪拌過程中的剪切效果。一般情況下,可以利用下列措施改善傳質狀況:以顆粒狀多孔或纖維狀物質作為底物,減小底物厚度,增大底物間空隙,使用多孔淺盤發酵,攪拌底物或使用轉鼓反應器。目前利用較多的方法是把強制通風和攪拌相耦合起來[8]。

3固態發酵設備

固態發酵反應器的研制對固態發酵的工業化推廣應用具有重要意義。通過對固態發酵傳質、傳熱和微生物生長數學模型的研究,近年來在規?；虘B發酵反應器的研制上有著顯著的進展[26]。根據基質的運動情況,固態發酵反應器可以分為兩類:靜態固態發酵反應器,在靜態體系中,整個發酵過程中固態基質保持不動,包括淺盤式生物反應器、填充床式生物反應器等;動態固態發酵反應器,體系中存在物料的混合過程,包括機械攪拌的筒、柱式反應器、流化床式生物反應器和轉鼓式生物反應器等。按照固態發酵反應器規模的級別大小可以將其分為3種:實驗室規模固態發酵反應器、中試固態發酵反應器和工業級固態發酵反應器。Durand[27]對各種級別的固態發酵反應器進行了詳細的介紹。陳洪章等[28,29]研制出了一種工業級的氣相雙動態固態發酵反應器,基本思想是對固態發酵罐內的氣相壓力人為施以周期脈動,脈動的周期、振幅及波形將隨不同發酵對象、發酵時間而改變;其次,在氣相雙動態固態發酵罐內設循環、風道及多組冷卻排管,強制帶走物料中的熱量,并強制熱空氣與冷卻盤管熱量交換,降低發酵物料的溫度,并保證了發酵溫度與濕度的均勻一致與可調性。發酵過程中溫度、濕度、pH值可控,保證純種發酵,實現了規?；I生產,設備投資和生產成本都遠低于液體深層發酵。用蘇云金芽孢桿菌進行生產固態發酵,平均毒力效價16 000 IU/mg,最高批次達23 000 IU/mg。用白僵菌進行固態發酵,效價可比淺盤培養提高2～3倍。

4生物農藥毒力檢測

毒力檢測是對生產出來的生物農藥進行質量檢驗的重要項目。通過毒力檢測可以檢驗發酵結果并指導發酵過程的改進和優化。應用于生物農藥毒力檢測的主要方法有孢子計數法,生物測定法、高效液相色譜法、免疫分析法、質譜分析法、電泳分析法等[30]。

生物測定法進行生物農藥的毒力檢測是行業標準檢測方法,普遍應用于實驗和生產。其毒力檢測方法以敏感昆蟲為試蟲,同時檢驗供試樣品和標準樣品對蟲子的致死中濃度LC50值,并計算待測樣品的毒力效價,以此來估計供試樣品的毒效。方蘋等[31]使用小菜蛾測定固態發酵生產出的蘇云金芽孢桿菌的毒效,采用浸葉碟飼喂法檢測,用純水將試樣稀釋處理,然后將苞菜葉碟在藥液中浸漬10 s,取出自然晾干,分別飼喂3齡幼蟲,于72 h檢查幼蟲死活情況,計算死亡率。余子全等[32]建立了一套蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白對植物寄生線蟲的生物測定方法。生物測定法可以直觀的反應菌株或制劑的毒力,但是需花費大量時間飼養昆蟲,而且操作程序復雜,易受被測試昆蟲的蟲齡、環境條件等因素影響。

倪鈺萍等[33]對SDS-PAGE毒素蛋白測定、生物測定、活芽孢計數3種測定蘇云金芽孢桿菌的方法進行了比較,通過對這3種方法適用范圍、定性定量分析、試驗周期、穩定性、可重復性、允許相對偏差等因素的考察,綜合評價認為采用SDS-PAGE毒素蛋白測定更為適宜。

5結論與展望

通過對文獻的分析可以看出,固態發酵在生物農藥生產應用領域的研究得到了巨大發展:發酵原料來源廣泛,既實現了生物農藥的有效發酵,又對一些工農業廢棄物實現了資源再利用;發酵條件和影響參數的控制研究逐步深入;工業化固態發酵反應器大量出現;毒力檢測方法多樣化。但是與液體深層發酵相比,目前固態發酵技術還缺乏全面的詳細研究,距工業化大規模的最優化生產仍有很大距離。不過隨著固態發酵技術優勢被越來越多的人認識到,固態發酵研究必將得到更多地重視,得到更大地發展,從而推動生物農藥產業的進步。

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