白腐真菌在木質素微生物降解中的作用

范 寰 梁軍峰 趙 潤 張金鳳 張洪生

摘要:對木質素降解的研究進展、白腐真菌對木質素降解的機理以及白腐真菌在飼料資源開發中的應用進行了綜述,并對白腐真菌在木質素降解中的發展方向做了展望。

關鍵詞:白腐真菌;木質素;降解;木質素降解酶

中圖分類號:S816.3文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.007

Role of White Rot Fungi in Microbial Degradation of Lignin

FAN Huan1,2,LIANG Jun-feng3,ZHAO Run3,ZHANG Jin-feng3,ZHANG Hong-sheng3

(1.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Tianjin 300112,China;2.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300192,China;3.Agro-environmental Protection Institute,Ministry of Agriculture of China,Tianjin 300191,China)

Abstract:In this article, the development in lignin degradation and the degradation mechanism by white rot fungi and the application of white-rot fungus in animal feeds production were reviewed. And an exploration of future technical and strategic improvements in lignin biodegradation by white rot fungi was respected.

Key words:white rot fungi;lignin;degradation;ligninolytic enzymes

白腐真菌(white rot fungi)是指著生在木材上,菌絲穿入木質,侵入木質細胞腔內,能釋放降解木質素和其他木質組分的酶,以降解木材中的木質素、纖維素、半纖維素,引起木質白色腐爛的絲狀真菌的集合。白腐真菌的種類很多,絕大多數為擔子菌,少數為子囊菌。主要分布在革蓋菌屬(Coriolus)、臥孔菌屬(Poria)、原毛平革菌屬(Phanerochaete)、側耳屬(Pleurotus)及煙管菌屬(Sjekandera)等[1]。白腐真菌中研究歷史最久、關注最多、研究最透的是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Burdsal)[2]。白腐真菌是已知的唯一能在純系培養中有效地將木質素降解為CO2和H2O的一類微生物。近半個世紀,白腐真菌所具有的獨特的生理生化機制和強大的降解代謝能力,使其受到許多研究者的高度關注。

1木質素降解的研究

木質素是自然界中除了纖維素外的第二大聚合物,它不僅對農業、工業、環境有著重要的影響,也與人們的生活息息相關,是一種有價值的潛在能源。飼料中的粗纖維主要包括纖維素、半纖維素和木質素,很難被動物消化道產生的酶所消化吸收。其中反芻動物瘤胃微生物可以部分降解纖維素、半纖維素,對于木質素很難降解;而單胃動物對于粗纖維各種成分的消化利用更為有限。研究表明,木質素可以通過各種化學鍵與纖維素、半纖維素相連,形成更加復雜的物質——木質纖維素,因為木質素的存在,導致粗纖維系統中纖維素、半纖維素的降解率降低,因此木質素是影響飼料粗纖維消化率的限制因子。由于木質素與半纖維素、纖維素之間相互混雜和交聯,使得原可以被瘤胃微生物降解的纖維素及其它可消化營養成分也難以被降解,因此降低木質素含量、破壞其結構單元之間連接的各種共價鍵,對于提高農作物秸稈的營養價值具有重要意義。有試驗證明,由于粗纖維對豬消化道消化液的稀釋作用,消化酶對底物的作用受到限制,從而降低了淀粉消化率。廖玉英[3]等研究發現,隨著鵝日糧中粗纖維水平的增加,飼料轉化率和日增重顯著下降。

木質素由3種以苯丙烷為主體的木質素單體組成,包括愈創木基結構、紫丁香基結構和對羥苯基結構,也有認為木質素是由四種醇單體(對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復雜酚類聚合物。木質素單體通過醚鍵等化學鍵相連,形成具有三維網狀結構的大分子芳香族化合物。在植物細胞形成過程中,木質素和纖維素、半纖維素等交聯沉積在細胞的初生壁和次生壁中,木質素還可與多糖通過阿魏糖橋交聯從而影響了纖維多糖的微生物降解,木聚糖彼此交聯及與木質素的交聯使細胞壁不易降解,只有低于50%的纖維部分可被動物消化吸收。木質素作為一種物理屏障降低了飼料的營養價值。因此,降低飼料細胞壁中木質素含量,使木質化細胞易被消化,則能顯著提高飼料的可消化性和利用率。

目前,木質纖維素的處理方法大致可分為物理法、化學法、物理化學法以及生物法[4]。物理處理技術主要有:機械粉碎、微波、超聲波、高能電子輻射、熱解等。物理方法處理時間短,操作簡單,但設備投資費用高。化學處理方法主要是:酸處理、堿處理、氧化處理、氨水浸泡處理、氨回收浸沒(ARP)處理、石灰處理等,但存在腐蝕和毒性等缺點,易造成環境污染,需回收。生物法主要研究的有真菌(白腐菌、褐腐菌、軟腐菌)、基因工程菌、酶類(多酚氧化酶、漆酶、過氧化氫生成酶、苯醌還原酶)等。生物法具有能耗低、無污染、條件溫和等優點,但周期長[5]。

2白腐真菌對木質素降解機理的研究

2.1木質素降解酶系的組成

白腐真菌所具有的降解木質素的能力源于白腐真菌所產生的酶系統,分解木質素需要依靠一個復雜的胞外過氧化物酶系統,這一系統主要由3種酶構成:木質素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac),另外還有其它幾種酶的綜合作用[6]。與降解有關的酶只有當某些主要營養物(如氮、碳、硫)限制時才形成。由于營養限制使真菌應答產生了對底物的降解系統[7]。

2.2白腐真菌木質素降解酶系的降解機理[8]

降解是以自由基為基礎的鏈反應過程。在有氧條件下,H2O2激活過氧化物酶,過氧化物酶觸發啟動高度活性的自由中間體形成,繼而以鏈反應過程產生許多不同自由基,促使底物氧化。這種自由基反應是高度非特異性和無立體選擇性的,即白腐真菌與被降解底物并非酶與底物的一一對應關系,而是與一類乃至多類底物的關系[9]。

LiP和MnP均為血紅素蛋白,催化過程中依賴H2O2。一般認為,LiP首先從木質素或木質素模型化合物中產生一個電子,形成陽離子基團,進而導致裂解反應,引起丙基側鏈Cα—Cβ鏈斷裂,后者再經歷一系列非酶反應產生各種終產物。

MnP既可氧化酚型結構也可氧化非酚型結構,其能將Mn(II)氧化成Mn(III),而Mn(III)是氧化劑,可在離MnP活性位點一段距離的地方起作用,但不能氧化非苯酚結構,只能通過Cα芳基開裂和其他降解反應氧化木質素中約占10%的抗性更強的酚結構。

Laccase是一種含銅多酚氧化酶,主要攻擊木質素中的苯酚結構單元,在反應中,苯酚的核失去一個電子而被氧化,產生含苯氧基的自由活性基團,可導致Cα氧化、Cα—Cβ裂解和烷基芳香基裂解。由于Laccase同時具有催化解聚和聚合木質素的作用,因此單獨存在時不能降解木質素,只有同時存在MnP等其他酶,避免反應產物重新聚合時,才有較高的木質素降解效率。漆酶可在僅有碳源存在的條件下由菌體分泌,并且具有780 mV氧化還原電位,在沒有H2O2和其他次級代謝產物的存在下可催化有機污染物的氧化[10]。

3白腐真菌在飼料資源開發中的應用

3.1白腐真菌提高秸稈飼料的品質及利用率

農作物秸稈營養成分的特點是蛋白質、可溶性碳水化合物、礦物質的含量低,而粗纖維含量高達35%～40%,還含有6%～12%的木質素,無氮浸出物達40%～50%。秸稈的營養價值主要取決于秸稈有機物的消化利用程度。在秸稈有機物中,纖維素、半纖維素和木質素是微生物重要的分解對象,而木質素由化學特性十分穩定的化合物形式構成,極難被一般微生物分解,動物無法吸收利用。纖維素和半纖維素易被微生物或酶分解,但木質素是纖維素的外圍基質,將纖維素緊緊包裹在其中,并且家畜瘤胃微生物缺乏降解木質素的酶,從而阻礙了家畜對纖維素和半纖維素的有效利用,導致秸稈的消化率降低。因此,提高農作物秸稈利用率的關鍵就是降解木質素[11]。

白腐真菌可使秸稈中木質素降解率達到20%~60%,纖維素和半纖維素降解率達到20%~40%,干物質損失10%~40%。用白腐真菌發酵切碎的麥秸,1個月后不僅粗蛋白質含量有所提高,且秸稈的消化率可提高2~3倍。用白腐真菌發酵稻草時,發酵后其木質素含量降低13.7%~29.9%。蛋白質含量增加24.6%~72.4%。由于大部分木質素被降解或破壞,秸稈質地變柔軟,適口性改善,明顯提高了秸稈的體外干物質消化率(IVDMD)。

用20多種白腐真菌處理秸稈的研究表明:白腐真菌表現出較強的種間變異,同時培養發酵的條件不同,處理秸稈的效果也不同。但是經篩選和選育的優良菌種,在適當環境條件下,固體發酵能顯著地改善秸稈的營養價值。檢測表明,最佳的白腐真菌能使秸稈體外降解率從40%提高到59%。白腐真菌處理的秸稈不僅營養成分有極大提高,而且其酸度由未處理前的pH值 5.17降至4.10左右,呈水果香味,同時由于大部分木質素被降解或破壞,秸稈質地柔軟適性明顯改善[12]。

3.2混菌發酵生產蛋白質飼料

應用白腐真菌處理秸稈,可以提高秸稈的利用率,但是一些降解產物仍得不到充分的利用。為此,科研人員利用白腐真菌降解秸稈木質素的能力和其它微生物發酵生產蛋白質飼料或單細胞蛋白(SCP)的能力,進行混菌發酵。陳慶森等[13]以玉米秸稈為原料,利用多菌種混合發酵,經測定發酵液中玉米秸稈的纖維素利用率達70%,粗蛋白質得率在23%以上,大大提高了玉米秸稈的營養價值。齊剛[14]以酒糟和稻草為基質進行混菌發酵,分別比較了白腐菌單菌發酵、酵母菌單菌發酵和二者混菌發酵對蛋白提高的影響。實驗表明,混菌發酵對蛋白提高的貢獻最大。通過比較酵母菌不同接種時間,發現白腐菌培養20 d后接人酵母可使蛋白含量達到6.45%。

4白腐真菌降解木質素的局限性和發展方向

白腐真菌以其獨特的生理生化機制和強大的降解代謝能力而成為木質素降解研究的模式菌株。白腐真菌雖然是降解木質素最有效的微生物,但由于其培養時受許多外部條件的影響,因此,目前大多數的研究還僅限于實驗室的發酵處理。而且在自然狀態下,白腐真菌的定植緩慢,很難形成優勢種群,這是該菌用于木質素降解并進入產業化的最大障礙。目前,生物降解多采用混合發酵,但由于菌種的不同來源和相容性的差異,各個菌株之間營養條件和生長條件有所不同,使混合發酵降解率也受到限制,至今不能達到高降解的目的[15]。因此,篩選出高效低能耗的木質素分解菌種以及能在飼料上迅速生長,且與雜菌在生長競爭中處于生物量的絕對優勢的優良菌種,并采用分子生物學方法構建具有木質素降解基因和纖維素酶基因的工程菌[16,17],是未來的發展方向。隨著白腐真菌基礎研究和應用研究的進展,其在畜牧業中將得到更廣泛的應用,將為我國飼料資源的開發利用提供更廣闊的空間。

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