走近綠色熒光蛋白

魯恒星　華朝陽

摘要以高中生物教材為切入點，以諾貝爾化學獎為背景，從來源、分子結構、發光機制、研究歷程以及在生物技術中的應用等方面對綠色熒光蛋白進行了概述。

關鍵詞熒光現象綠色熒光蛋白熒光標記

中圖分類號Q-49文獻標識碼E

現行高中生物教科書(人教版)中，多處描述了熒光標記技術，并有有關熒光蛋白的描述，如熒光標記的小鼠細胞和人細胞融合實驗、熒光標記技術與基因定位、熒光鼠的培育等。2008年10月8日，瑞典皇家科學院把今年的諾貝爾化學獎授予綠色熒光蛋白的發現者和推廣者。于是，筆者搜集并整理了有關資料，從綠色熒光蛋白(GFP)的來源、分子結構、發光機制、研究歷程以及在生物技術中的應用等方面進行概述。

12008年諾貝化學獎及獲獎者簡介

日本的下村修、美國的馬丁·沙爾菲和美籍華人錢永健于2008年10月8日，因對綠色熒光蛋白(GFP)的研究，分享了今年的諾貝爾化學獎。他們的研究歷程，猶如一場接力跑：下村修發現了GFP，沙爾菲確定了它的應用價值；而錢永健則讓它變得多樣化。

下村修現年80歲，生于京都，長于長崎。1960年獲得名古屋大學理學博士學位后赴美，先后在美國普林斯頓大學、波士頓大學和伍茲霍爾海洋生物實驗所工作。1962年他發現熒光蛋白，被譽為生物發光研究第一人。從33歲做出重要發現，到46歲完成全部關鍵實驗，他的研究遙遙領先，卻一直默默無聞。2001年退休后，年逾七旬的下村修繼續在家里的地下室潛心研究。

馬丁·沙爾菲現年61歲，美國哥倫比亞大學生物學教授，他在利用綠色熒光蛋白做生物示蹤分子方面做出貢獻。

錢永健1952年出生于美國紐約，現為美國加州大學圣迭戈分校生物化學及化學系教授、美國國家科學院院士、國家醫學院院士，2004年沃爾夫獎醫學獎得主。他發明的多色熒光蛋白標記技術，將為細胞生物學和神經生物學發展帶來一場革命。

2熒光現象

一些化學物質能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能、x線或陰極射線等)而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式散失(即發光)，這種現象就是熒光現象。可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光。而一旦停止供能，發光(熒光)現象也隨之瞬間消失。

3綠色熒光蛋白(GFP)的來源、分子結構和發光機制

綠色熒光蛋白最初在海洋無脊椎動物——維多利亞多管水母中被發現。野生型的GFP的分子量約為27kD，單鏈，由238個氨基酸殘基組成。GFP具典型的β桶形結構，包含β折疊和α螺旋，由周圍11個β-折疊片圍繞中央1個α-螺旋構成，發光中心位于中央的α-螺旋結構中，嚴密的桶形結構保護著發光中心，防止它被周圍環境淬滅。GFP的發光中心由六肽組成，發光團是其中的Ser65-Tyr66-Gly67三個氨基酸殘基經過環化、脫氫后形成的咪唑環。發光中心周圍的殘基與發光中心相互作用對GFP發光產生影響。GFP這種堅實的結構保證了其穩定和抗熱、抗變性的特點。GFP的真正的發光部位為咪唑環上的陰離子酚，Tyr66的脫質子(酚鹽)和質子化狀態(羥酚基)的轉換決定熒光發射。野生型GFP有2個吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，兩種波長的任何一種光激發均可使GFP產生509nm的綠色熒光。

盡管野生型GFP能發出很絢麗的熒光，但它還是有不少缺點，比如有兩個激發峰、光穩定性不好，在37℃不能正確折疊等。研究人員通過定點或隨機突變，不斷地改造發光基團周圍的殘基，得到了多種改良型的GFP。S65T點突變獲得的GFP，光譜性質顯著提高，熒光強度和光穩定性也大大增強，激發峰轉移至488nm，而發射峰仍保持在509nm，使GFP的應用潛力得到有效提高；F64L點突變獲得的GFP，在37℃的折疊能力得到改善；顏色突變獲得多色熒光蛋白，如藍色熒光蛋白、青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白；另外，還獲得了對pH敏感的突變體等。目前，GFP家族已經變得絢麗多彩。

4綠色熒光蛋白的研究歷程

GFP發光不同于螢火蟲發光，螢火蟲是由熒光酶催化底物分子——熒光素以后產生熒光；而GFP發光是蛋白質本身發光，無需底物。之前就有人研究生物發光現象，蛋白質本身發光的研究則源于下村修和約翰森的發現。

1955年，有人發現水母可以發綠光，但不知其因。1962年，下村修和約翰森從水母中分離生物發光蛋白——水母素時，意外地發現了一個副產物——GFP，它在陽光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發強烈綠色。1974年，他們得到了這種蛋白質。GFP在水母中之所以能發光，是因為水母素在鈣刺激下發光，其能量可轉移到GFP，刺激GFP發光。這是物理化學中已知的熒光共振能量轉移在生物中的發現。水母素是熒光酶的一種，它需要熒光素才能發光，而GFP是蛋白質本身發光，在原理上有重大突破。

下村修做GFP研究時只是對生物發光好奇，而對GFP的應用前景不感興趣，也沒有意識到應用的重要性。1992年，有人拿到了水母素和GFP的cDNA。有了基因序列，很多人嘗試將GFP表達到其他生物體中，但都失敗了。1994年沙爾菲利用PCR技術擴增了GFP的編碼區，成功地將它克隆到大腸桿菌和線蟲細胞中，通過紫外線或藍光激發，均產生了很美妙的綠色熒光。首次證實了GFP作為發光標記物用于生物學研究的價值，這才是GFP作為熒光指示劑的真正突破。

沙爾菲的研究立即引起轟動，許多生物學研究者紛紛將GFP引入自己的研究對象。從1961年到1974年，下村修和約翰森的研究遙遙領先但很少有人注意。在1974年以后的后繼工作，主要是跟風研究，其中例外的是錢永健的工作。

1994年，錢永健通過定點或隨機突變，首次完成對GFP發光基團周圍殘基的重大改造，從而改進了GFP的發光強度、發光顏色，使GFP家族變得絢麗多彩。目前，世界上使用的熒光蛋白大多是錢永健實驗室改造后的變種。他發明了更多應用方法，闡明了發光原理。

5應用與展望

GFP在多種條件下穩定，分子量小；GFP基因序列較短，可以與其他基因一起構建到載體上進行高效轉化；GFP基因沒有物種特異性，在原核、酵母、植物以及動物細胞中都獲得了成功表達，大量表達對細胞沒有毒性；GFP熒光穩定，適用于定量測定與分析。GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產生不需要任何外源反應底物，通過常規的基因操縱手段，用熒光蛋白來標記目標蛋白，可跟蹤和判斷生物細胞的分子變化。因此人們將綠色熒光蛋白喻為生物化學中的“北斗星”。21世紀初，在它的指引下，人們深入到大片未知的科學處女地，看到了以前所不能見的新世

界，研究成果層出不窮。

5.1目標蛋白的位置及動態變化的觀察

利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉入合適的細胞進行表達，然后通過熒光顯微鏡，借助閃閃發光的標簽工具(GFP)便能觀察到令人感興趣的、通常肉眼看不見的蛋白的運動、定位及它們之間的互動。利用這項技術科學家已經加深了對細胞細胞分裂、染色體復制和分裂，發育和信號轉導等過程的了解。其中，做得最漂亮的當屬“腦虹”實驗，即對3種不同顏色的GFP加以調配，變成6種顏色，然后將它們分別“轉移”給不同神經細胞，用以觀察它們的生長過程及其相互關系。一些實驗室甚至“生產”出了可人為控制顏色的熒光魚、熒光鼠、熒光豬等。

5.2細胞器的標記

GFP在接上各種細胞內定位序列后，在活體中可直接觀察各種亞細胞結構及其生活狀態。已有大量實驗報道表明GFP可定位到細胞核、線粒體、內質網、質膜及核膜孔等。各種基因突變體的產生也使得定位在很小區域內的GFP能很靈敏地被檢測到。同樣，利用GFP能在各種亞細胞結構中表達的特性可以研究某些序列的定位特性及分析定位序列的結構特征等。

5.3DNA標記

GFP除了可標記蛋白質外，也可用于標記DNA。細菌lae阻遏蛋白(laeI)能與它的目標DNA(lae操縱子，lacO)緊密和特異結合，用GFP與laeI可構建產生laeI-GFP，將laeO序列插入到細胞的基因組中，然后在活細胞中可直接觀察laeI-GFP與laeO的共定位地點，利用這種技術已成功地在哺乳動物細胞、酵母及細菌中活體標記了DNA序列。

5.4分析病原物與宿主關系

傳統方法必須在分析前對組織進行處理，但這樣就阻止了感染的繼續進行。GFP的出現可有效地克服這一弊端。研究表明，移動蛋白MP對病毒的細胞間移動是絕對必需的。將GFP與TMV(煙草花葉病毒)的MP融合，可用來跟蹤MP在亞細胞間的移動、監測MP分子與宿主蛋白的關系及分離與之相互作用的成分等。運用這種方法人們可以跟蹤病原物對宿主的感染途徑，研究病原物與宿主的相互關系、藥物的作用情況等。

5.5藥物篩選

新發展的光學分析方法已經開始利用活體細胞來進行藥物篩選，這一技術能從數量眾多的化合物中快速篩選出科學家所感興趣的藥物。在細胞內分子之間的相互作用非常復雜，其中很多涉及到信號分子與某受體結合后的遷移，而這一遷移過程通常與細胞的某生理功能有關。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數量眾多的化合物中判斷哪些化合物具有與信號分子相似的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。

5.6融合抗體

近20年來，抗體生成技術有了飛速發展，已經從細胞工程抗體(雜交瘤技術——單克隆抗體)發展到了第三代抗體：基因工程抗體。融合抗體屬基因工程抗體，它具有與抗原結合及發射熒光兩種特性，由于技術上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達系統如大腸桿菌中表達。若能成功解決其表達問題，則融合抗體將在免疫染色及腫瘤檢測這一領域扮演極為重要的角色。

5.7生物傳感器

利用蛋白質工程技術將一具有信號傳導功能分子識別位點的分子結合到另一分子上可以設計生物感受器。綠色熒光蛋白以其獨特的光信號傳導機制，以及在表達后易被周圍化學環境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細胞體內的光學感受器。第一個基于GFP的生物感受器為Ca²感受器，原理是利用鈣調蛋白結合鈣離子后引起的空間構象變化導致兩種GFP突變體間發生熒光共振能量轉移。但是由于大多數蛋白不能像鈣調蛋白那樣承受較大的空間構象變化，為克服這一缺點，人們開始提出利用基因融合技術將一新的分子識別位點結合到GFP上以構建新的分子感受器。將受體蛋白插入到GFP表面的技術已經成為構建分子感受器的有力工具。將來，GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應用前景極為廣闊。

不過熒光蛋白也存在著一些不足，主要表現在GFP從表達到成為具有熒光活性形式的過程比較慢，因而對某些細胞動力學過程不能實時監測，檢測的靈敏度也需要進一步提高，某些細胞的螢光背景會影響GFP的檢測。但隨著對GFP研究的深入，預計將會有更多突變改進型的GFP出現，可以逐步克服上述的一些缺點，推動GFP在生命科學研究中更廣泛的應用。21世紀是生物學世紀，在綠色熒光蛋白與其他技術變革的共同推動下，這個預言將真正有可能成為現實。