大白菜雜交種中熟5號純度的RAPD鑒定

方淑桂 曾小玲 陳文輝 陳銑

（福州市蔬菜科學研究所，福建福州350012）

大白菜雜交種中熟5號純度的RAPD鑒定

方淑桂 曾小玲 陳文輝 陳銑

（福州市蔬菜科學研究所，福建福州350012）

利用RAPD-PCR分子標記技術，對大白菜品種中熟5號及其親本的DNA指紋進行了分析研究，從200個隨機引物中篩選出互補帶明顯的引物S33，構建了相應的DNA指紋圖譜。通過對100株中熟5號進行純度鑒定，結果只有2個有母本特異帶，與大田檢測的結果完全一致，雜交率達98%。

大白菜 中熟5號 RAPD-PCR 種子純度

種質和新品種鑒定是農作物新品種開發利用及知識產權保護的依據，目前國內外對農作物品種仍以形態指標鑒定為主，其特點是準確可靠，但檢測周期長，不能滿足當年用種需要。為縮短鑒定周期，同工酶技術已應用于十字花科蔬菜雜種純度鑒定，但同工酶多態性不夠豐富，同時有組織和器官特異性，大大降低了鑒定的穩定性和準確性。隨著分子生物學的快速發展，DNA分子標記技術得到全面發展，以PCR為基礎的DNA分子標記技術，如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以發展與應用。而RAPD分子標記技術具有簡單易行、DNA需要量少、檢測效率高、試驗周期短、隨機引物選擇不受種屬的限制等優點，已被廣泛應用于多種作物的種子鑒定[1～5]。

本研究以中熟5號[6]及其親本為材料，采用RAPD分子標記技術，建立中熟5號品種及其親本的DNA指紋圖譜，為其純度鑒定和知識產權保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大白菜品種中熟5號及其親本均由福州市蔬菜科學研究所大白菜課題組提供，采用穴盤育苗，待幼苗長至2片真葉時取嫩葉供試驗用。RAPD引物購自上海生工生物工程技術有限公司。

表1 不同引物擴增多態性情況

1.2 試驗方法

①DNA提取 隨機抽取大白菜品種中熟5號及其父母本各15株，剪取剛展開的健康嫩葉，液氮研磨，采用改良的CTAB法[7]提取總DNA，用紫外分光光度計在260 nm和280 nm下測定OD值，檢測DNA的質量和濃度，并稀釋到30 ng/μL作為PCR擴增的模板。

②RAPD分析 大白菜RAPD-PCR反應體系優化為25 μL，其中含2.5 μL 10×PCR buffer，250 μmol/L dNTP，0.5 μmol/L引物，2.5 mmol/μL MgCl2，30 ng模板DNA，1 U的Taq酶。

PCR擴增反應在PCR儀上進行，PCR擴增程序為：94℃預變性 4 min；92℃ 60 s，37℃ 90 s，72℃120 s，40個循環；72℃7 min；4℃保存。反應結束后，PCR產物在含有0.5 μg/mL EB的1.4%瓊脂糖凝膠中電泳2 h，用捷達凝膠成像系統進行拍照分析。

圖1 混合中熟5號品種和父母本基因組DNA的RAPD-PCR擴增

圖2 S33擴增F1及其親本的DNA圖譜

2 結果與分析

2.1 特征引物的篩選

用生工S1～S200共200個隨機引物，隨機提取父本、母本及雜交種15株，建立混合池，進行RAPDPCR引物篩選。結果有40個引物擴增出1～4條帶，121個引物擴增出5～10條帶，18個引物擴增出10條以上條帶（圖1）。

選取擴增帶譜清晰，模糊帶和雜帶少，主帶突出的70個引物分別擴增大白菜早熟5號雜交種和父母本的基因組DNA。結果顯示，有10個引物擴增出多態性帶（表1）。其中有4條引物擴增的雜種譜帶與父本有差異；有2條引物擴增的雜種譜帶與母本有差異；有4條引物擴增的雜種譜帶與父母本有差異，分別是引物S4，S33，S155和S170。其中引物S155擴增的與父本的特異帶譜比較模糊；引物S170擴增的與其父母本相比，缺失1條父本特異帶和2條母本特異帶；引物S4擴增的與其父母本相比，缺失1條母本特異帶。經多次反復試驗，篩選出1個特征引物S33，能同時擴增出早熟5號的雜種及其父母本的多態性條帶，其擴增產物具有高度的穩定性和重復性。

2.2 指紋圖譜的建立

從圖2可以看出，用引物S33擴增中熟5號雜交種及其親本基因組DNA，母本有一條明顯特異帶S33-1500，父本有一條明顯的特異帶S33-550，雜交種同時有這兩條明顯的特異帶。

2.3 雜種純度的鑒定

將中熟5號雜交種種植于大田中，待幼苗長至2片真葉時，隨機抽取100個單株編號，按上述方法提取DNA，選用引物S33進行RAPD的分子鑒定。檢出2個單株無父本特異帶，說明2株是母本苗，雜交種的純度為98%。成株期鑒定生物學性狀，結果發現2株與母本性狀一樣，植株矮小、結球松，其余的均結球大而緊實，雜交率為98%。

3 小結

本試驗通過優化DNA提取程序，嚴格控制DNA模板質量，優化反應體系，多次重復篩選，獲得多態性穩定且互補帶明顯的特征引物S33，建立了中熟5號大白菜DNA指紋圖譜。在生產田中隨機抽取單株并編號，苗期提取DNA進行RAPD分子鑒定，與成株期形態鑒定結果相對應，植株矮小結球松散的與分子標記缺失父本帶的一致，這樣更準確地鑒定中熟5號雜交種純度，說明利用DNA指紋圖譜進行大白菜品種鑒定是可行的。

[1]賈繼增.分子標記種質資源鑒定和分子標記育種[J].中國農業科學，1999，29（4）：1-10.

[2]李莉，邵登魁，鐘啟文.RAPD技術在蔬菜種質資源研究中的應用[J].青海大學學報：自然科學版，2007，25（5）：58-61.

[3]郝風，李成瓊，宋明，等.西園四號甘藍純度的RAPD鑒定及其在雜交制種中的應用[J].中國農學通報，2006，22（5）：43-45.

[4]戴修純，王佛嬌，謝偉平，等.利用RAPD技術快速鑒定番茄種子純度[J].中國蔬菜，2006（8）：23-24.

[5]Ballester J G.Determination of hybrid seed purity inpepper using PCR-based markers[J].Euphytica，1998（3）：212-219.

[6]方淑桂，陳文輝，曾小玲.大白菜新品種中熟5號的選育[J].中國蔬菜，2001（6）：32-33.

[7]王關林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2002：742-744.

Identification of Seed Purity of Hybrid Chinese Cabbage Zhongshu No.5 by RAPD Markers

FANG Shugui,ZENG Xiaoling,CHEN Wenhui,CHEN Xian
(Fuzhou Institute of Vegetable Science,Fuzhou 350012)

Using the RAPD-PCR molecular marker technology,the DNA fingerprints of Chinese cabbage Zhongshu No.5 and their parents were analyzed.A characteristic primer S33 showed complementary type bands of their parents was screened from 200 random primers.The DNA fingerprinting of Chinese cabbage Zhongshu No.5 was constructed,which adopted to identify the seed purity of Chinese cabbage Zhongshu No.5.Using the purity identification method,two plants showed female parent bands in 100 Zhongshu No.5 plants,which was exactly the same with the field testing.The hybrid rate was 98%.

Chinese cabbage;Zhongshu No.5;RAPD-PCR;Seed purity

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.006

科技部成果轉化資金項目（02EFN213500309）；福建省科技成果轉化重點項目（2006T0030）

方淑桂（1956-），女，大專，研究員，研究方向為蔬菜遺傳育種和生物技術，電話：13720836739。E-mail：fangshugui@126.com

2008-10-17