微型薯多酚氧化酶的特性研究

謝奎忠 陸立銀

（甘肅農業科學院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州，730070）

微型薯多酚氧化酶的特性研究

謝奎忠 陸立銀

（甘肅農業科學院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州，730070）

對分離純化后的微型薯的多酚氧化酶性質進行研究，以鄰苯二酚為作用底物，用分光光度計在波長 420 nm處測定不同 pH值、反應溫度、底物條件下微型薯的多酚氧化酶（PPO）活性，以討論微型薯的褐變機理。結果表明，微型薯的 PPO最適 pH值 約為 5.5，最適反應溫度為 35℃左右，該酶熱穩定性差；最適作用底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸；FeSO4和抗壞血酸等化合物可以抑制 PPO活性，CaCl2和CuSO4等則起促進作用。適度高溫、強酸性或堿性條件、FeSO4或抗壞血酸等處理都可以抑制該酶活性。

微型薯 多酚氧化酶 酶學性質

隨著我國馬鈴薯產業的迅速發展，脫毒微型薯在種薯中的應用越來越廣泛；因此，微型薯的貯藏問題越來越突出，儲藏條件與微型薯的腐爛率、出苗率以及長勢密切相關。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一種含銅酶，它能夠催化酚類物質變成醌[1～2]。近幾十年來，國內外對植物組織的褐變研究表明，組織的褐變主要是由于PPO活性引起的。有關馬鈴薯PPO的研究早有報道，如PPO活性在不同組織中的表現，有機酸對組織中PPO活性的影響[3～4]，貯藏溫度、pH值對馬鈴薯PPO活性的影響[5]。但是，目前對微型薯中的 PPO特性研究還未見報道。本試驗對微型薯經分離純化后的酶學特性等進行研究，以明確該酶性質，為控制微型薯在貯藏過程中褐變提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將分離純化后的甘農薯1號微型薯薯肉 66 kD的PPO作為酶反應液，研究其酶學性質。分離純化參考林敏等[6]的方法進行。

1.2 試驗方法

①PPO活性 PPO活性測定參考Zauberman等[7]方法進行。把0.5 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚加入1.95 mL 50 mmol/L pH值6.8的磷酸緩沖液中，在38℃下保溫10 min后，加入0.1 mL酶粗提液，于波長420 nm下測定OD值變化，每隔 1 min記錄1次，共記錄10 min。以每分鐘 OD420變化 0.01為一個PPO酶活性單位。

②PPO最適 pH值 酶反應液組成和酶活性測定條件同上，配制不同pH值 的 0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液按照 Fujita等[8]的方法進行。

③PPO的最適反應溫度和對溫度的穩定性PPO最適反應溫度測定采用 Zhou等[9]的方法進行。將1 mL 100 mmol/L的鄰苯二酚、1.95 mL 0.1 mol/L pH值 6.8的磷酸緩沖液和 0.1 mL酶液混合液在不同溫度（20～50℃，間隔溫度為5℃）水浴中分別保溫10 min，加入20%三氯乙酸2 mL終止反應，冷卻至室溫（18.5℃），在分光光度計 420 nm處測定光密度。PPO熱穩定性測定是先將0.1 mL酶液與3.9 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液混合，分別在不同溫度水浴中保溫10，20，30 min，然后在冰浴中迅速冷卻5 min。當混合液溫度達到室溫（18.5℃）時，加入1 mL 100 mmol/L鄰苯二酚。之后按①的方法測定殘余酶的吸收值的變化。

④底物濃度對 PPO活性的影響 用 pH值6.8的0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制鄰苯二酚溶液。向裝有5 mL鄰苯二酚溶液（1～50 μmol/L）的比色杯中加入1 mL酶液，在分光光度計420 nm處測定PPO吸收值變化，并計算酶活力。

⑤酶底物專一性 按照 Wong等[10]的方法測定。PPO反應系統含0.05 mL酶液和2.95 mL不同底物溶液（沒食子酸、綠原酸、原兒茶酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等，使用 0.1 mol/L磷酸緩沖液調配，其中阿魏酸先用微量異丙醇溶解）。經 38℃保溫10 min后，加入 20%三氯乙酸 1 mL終止反應，反應產物用分光光度計對 200～500 nm波長進行掃描，確定特征吸收波長，在特征吸收波長處測定光吸收值的變化。

⑥不同化合物對PPO活性的影響 將0.5 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚與 1.85 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液和0.1 mL不同化合物溶液（CaCl2，CuSO4，EDTA，FeSO4，NaCl和抗壞血酸等，濃度均為1 mmol/L）均勻混合后，立即加入 0.05 mL酶液，用分光光度計在420 nm處測定 PPO吸收值變化，計算酶活力。酶活性大小以無化合物時酶活性百分比表示。

圖1 pH值 對微型薯多酚氧化酶活性的影響

圖2 溫度對微型薯多酚氧化酶活性的影響

圖3 微型薯多酚氧化酶對熱的穩定性

圖 4 底物濃度對多酚氧化酶活性的影響

表1 微型薯多酚氧化酶底物的專一性

表2 不同化合物對微型薯多酚氧化酶活性的影響

2 結果與分析

2.1 PPO最適反應pH值

以鄰苯二酚為底物，微型薯66 kD的PPO最適pH值為5.5（圖1）。當pH值低于3.0時，PPO不表現出活性。當pH值 大于5.5時，PPO活性迅速下降。

2.2 PPO最適反應溫度和熱穩定性

從溫度對 PPO活性的影響（圖 2）可以看出，微型薯PPO的最適反應溫度為35℃。在此溫度下，酶的相對活性為94%。當溫度超過40℃時，PPO活性急劇降低，微型薯PPO不耐高溫。

由圖3可以看出，微型薯 PPO的熱穩定性較差。在30℃熱處理30 min，酶活性僅損失36%；但當溫度高于40℃時，PPO活性損失較大。45℃處理10 min，PPO的活性損失達50%。在50℃下，保溫30 min，PPO的活性損失達80%，該酶基本上失去活性。

2.3 底物濃度對PPO活性的影響

從圖4底物濃度對PPO活性的影響可以看出，當底物鄰苯二酚濃度低于40 mmol/L時，底物濃度與PPO活性成正比，但當濃度高于40 mmol/L時，反應速度開始下降；這可能是由于產物的積累抑制了PPO的活力。

2.4 PPO對底物的專一性

分別對微型薯肉PPO與不同種類的游離酚酸底物作用后的產物進行 200～500 nm掃描，確定特征吸收波長。從表 1可以看出，以作用于沒食子酸的活力為100%計算，綠原酸的相對活力最大為324.3，是沒食子酸活力的3倍；其次為原兒茶酸226.0，是沒食子酸活力的2.6倍；咖啡酸的活力為132.0，是沒食子酸活性的1.3倍；香豆酸、阿魏酸的相對活力小于100%。所以微型薯66 kD的PPO的最適作用底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸。

2.5 不同化合物對PPO活性的影響

不同化合物對微型薯PPO活性的影響如表 2所示。在這些化合物中，以 FeSO4的抑制效果最好，其次是抗壞血酸。CaCl2和CuSO4能夠不同程度地促進PPO的活性。

3 小結

微型薯PPO的最適pH值約為5.5；最適反應溫度為 35℃左右，熱處理的穩定性差；最適反應底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸；FeSO4、抗壞血酸和 EDTA可以抑制 PPO活性，而CaCl2、和CuSO4則起促進作用。該酶耐熱能力差，適度高溫、強酸性和堿性條件、FeSO4和抗壞血酸處理均可以抑制該酶活性。

[1] Mayer A M,Harel E.Polyphenol oxidases in plants recent progress[J].Phytochem,1979(18):193-215.

[2] 宗亦臣.棗果實中酚類物質及其多酚氧化酶性質的研究[J].中國農學通報，2004，20（4）：97-99.

[3] 冉毅東，戴朝曦.馬鈴薯花藥培養硝酸銀對誘導胚狀體效果的研究[J].西北農學報，1993，2（4）：43-47.

[4] 劉曼西，于秀芝.有機酸對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響[J].植物生理學通訊，1991，27（5）：350-353.

[5] 王清，王蒂.溫度、pH對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響[J].中國馬鈴薯，2003，17（3）：157-161.

[6] 林敏，邱凌，周盛梅，等.4-鹵代苯甲酸對馬鈴薯多酚氧化酶的抑制效應[J].食品科學，2008，29（5）：56-59.

[7] Zauberman G,Ronen R,Akerman M,et al.Postharvest retention of the red colour of litchi fruit pericarp[J].Scientia Horticulture,1991,47:89-97.

[8]Fujita S,Tono T,Kawahare H.Purification and propetiesof polyphenoloxidaseinheadlettuce(Lactucasative)[J].Journal oftheScienceofFoodandAgriculture,1991,55：643-651.

[9] Zhou P G,Smith N L,Lee C Y.Purification and some propertiesofMonroeapplepeelpolyphenoloxidase[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,1993，41：532-536.

[10]Wong T C,Lun B S,Whitaker J R.Isolation and characterization of polyphenol oxidase isoenzymes of clingstonepeach [J].Plant Physiology,1971，48：19-23.

Study of Polyphenol Oxidase in Min-tuber Potato

XIE Kuizhong，LU Liyin
(Potato Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sicence,Lanzhou 730070)

Properties of polyphenol oxidase extracted and purified from min-tubers potato were studied to investigate the theory of browning.Polyphenol oxidase activities were spectrophotometrically determined at 420 nm with catechol as substrate at different pH,temperatures and substrate concentrations and so on.The optimum pH for PPO activity was 5.5 with catechol as substrate.The enzyme was relatively stable at low temperature,with the maximum activity was observed at 35℃.Chlorogenic acid,Protocatechuic acid,and Caffeic acid were good substrates for the enzyme.FeSO4and ascorbic acid markedly inhibited PPO activity,whereas CaCl2and CuSO4enhanced the activity.PPO of min-tuber potato was stable at low temperature,high temperature,high pH and ascorbic acid can inhibited the activities of the enzyme.

Min-tubers potato;Polyphenol oxidase;Enzymatic properties

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.01.012

甘肅省科技廳重大專項“貯藏保鮮技術與設施產業化示范”的子課題“馬鈴薯貯藏條件設施技術改造”項目(0702NKDA035)；甘肅農業科學院自列項目資助。

謝奎忠（1979-），男,碩士，主要從事馬鈴薯生理生態與栽培技術的研究工作，電話：0931-7614641。E-mail：xiekz@yahoo.com.cn

2008-11-21