黃瓜老化種子基因組DNA的損傷與修復(fù)的RAPD研究

伍春蓮 喬愛民 孫敏

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充，637002；2.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系；3.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

黃瓜老化種子基因組DNA的損傷與修復(fù)的RAPD研究

伍春蓮1喬愛民2孫敏3

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充，637002；2.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝系；3.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

應(yīng)用RAPD技術(shù)對人工老化和PEG處理的黃瓜種子進行擴增多態(tài)性DNA分析，建立了黃瓜種子基因組DNA的損傷及其修復(fù)的RAPD指紋圖譜。在92條引物中有22條可應(yīng)用于老化種子的研究，16條可應(yīng)用于PEG處理種子的研究，并從中找出了6條引物S190、S300、S359、S475、S1140、S2144用來比較黃瓜老化種子及其修復(fù)的RAPD擴增帶型的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工老化處理的黃瓜種子的DNA帶減少甚至消失，而PEG滲調(diào)修復(fù)后的黃瓜老化種子DNA帶重新出現(xiàn)或者與對照基本相同，從而建立了黃瓜老化種子基因組DNA的損傷與修復(fù)的RAPD指紋圖譜。

黃瓜種子 人工老化 DNA損傷與修復(fù) PEG滲調(diào) RAPD

黃瓜（Cucumis ativus）又名胡瓜、刺瓜、王瓜，屬葫蘆科黃瓜屬植物，具有清熱利水，解毒消腫，生津止渴的作用，具有很高的經(jīng)濟利用價值。黃瓜種子在貯藏過程中容易發(fā)生老化，導(dǎo)致種子質(zhì)量、活力和抗逆性降低，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。種子質(zhì)量是目前的研究熱點之一，但大多集中在生理生化方面，分子研究則主要集中在蛋白質(zhì)和RNA上，從DNA分子水平方面的研究卻少見報道[1]。

隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）是一種利用一系列10堿基的隨機引物對所研究的基因組DNA進行擴增的分子標(biāo)記[2～3]。RAPD能從DNA分子水平上直接反映整個基因組的特征，能快速、準(zhǔn)確地反映基因組DNA因發(fā)生DNA片段的插入、缺失，或發(fā)生堿基突變而產(chǎn)生的多態(tài)性信息[4]。RAPD技術(shù)自Williams于1990年創(chuàng)立以來，已經(jīng)在遺傳多樣性分析、品種鑒定、藥材的道地性以及栽培植物品種的分類研究等方面得到了廣泛應(yīng)用[5～10]。本文利用RAPD技術(shù)研究了人工老化過程中種子基因組DNA的損傷積累以及利用PEG（聚乙二醇）對損傷的DNA進行滲透修復(fù)，這在國內(nèi)外是一種新的嘗試，同時將蔬菜種子在人工老化處理過程中基因組DNA的損傷積累以及損傷DNA的PEG滲調(diào)修復(fù)對種子質(zhì)量的影響聯(lián)系起來，具有創(chuàng)新意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為黃瓜（Cucumis sativusL.）品種津研四號（Jin Yan No.4 cucumber）的種子。隨機引物均購自上海生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

①種子的人工老化 將黃瓜種子于40℃，RH 100%條件下進行老化處理。具體步驟如下：在干燥器底部盛一定量的蒸餾水，放在40℃的生化培養(yǎng)箱中，平衡水分2 d，再用小紗袋裝50粒大小均勻、種皮完好的種子，敞口放入干燥器中，再將干燥器密封，放入40℃的生化培養(yǎng)箱中。每天放入一批種子，共放入15批種子。然后將所有種子從干燥器中取出，于室內(nèi)條件下平衡水分。這樣就得到了不同老化天數(shù)的黃瓜種子（即不同活力的黃瓜種子）。

②老化種子的PEG滲調(diào)引發(fā) 在9 cm的培養(yǎng)皿中，加入適量的25%的PEG溶液，取老化的黃瓜種子50粒置于其內(nèi)，于15℃的光照培養(yǎng)箱中處理24 h。然后將種子取出，用蒸餾水沖洗5次，再用吸水紙將種子表面的水吸干，并用電風(fēng)扇將種子吹干至一定程度，最后于室內(nèi)平衡水分。

③種子基因組DNA的提取和RAPD方法 種子基因組DNA的提取采用SDS法[11]。

RAPD方法為：20 μL的反應(yīng)體系中含有60 ng模板，1.2 U Taq DNA聚合酶，3.0 mmol/L MgCl2，0.20 mmol/L dNTP，1.40 μmol/L引物，1×buffer，其余用雙蒸水補齊。DNA預(yù)變性94℃進行4 min，94℃變性30 s，37℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次后，72℃再延伸10 min。RAPD擴增產(chǎn)物的檢測：配制1.5%（w/v）的瓊脂糖凝膠，于1×TBE緩沖液中電泳檢測基因組DNA的擴增產(chǎn)物。電泳電壓為5 V/cm，1.5 h，溴化乙錠 （EB）直接加在瓊脂糖凝膠中，使其終濃度為0.5 μg/mL。待溴酚藍遷移至瓊脂糖凝膠的2/3處，取出膠在300 nm紫外透射光下觀察并拍照記錄。

④引物篩選 取 10粒沒有老化的種子提取DNA，作為篩選隨機引物的模板。

表1 多態(tài)性隨機引物的序列及擴增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選

在103條10 bp的單引物中總共有92條引物擴增出穩(wěn)定而清晰的產(chǎn)物，占總引物的89.3%，一般為2～10條片段，介于200～2000 bp。選用擴增產(chǎn)物穩(wěn)定而清晰的引物（表1），作為黃瓜老化種子基因組DNA損傷及其修復(fù)的RAPD的研究。

2.2 黃瓜老化種子及其PEG滲調(diào)修復(fù)的RAPD研究

試驗對經(jīng)40℃，RH 100%人工老化1～15 d的黃瓜種子進行RAPD擴增和用25%PEG 6000對人工老化不同天數(shù)的黃瓜種子進行滲調(diào)后的RAPD擴增。利用引物 S359，S475，S300，S190，S1140及 S2144進行DNA老化和修復(fù)的對照分析。由圖1可知，利用引物S359分析時發(fā)現(xiàn)，利用人工老化的黃瓜種子進行RAPD擴增，老化3，7，8，13，14 d的種子與對照相比，均無擴增條帶出現(xiàn)，而老化1，4，5，6，9，10，11 d的種子在約500 bp處均只有1～2條條帶，其余均丟失，說明經(jīng)過人工老化的黃瓜種子可能使基因組DNA受到了損傷，老化的天數(shù)不同，DNA損傷的程度也不同，表現(xiàn)為某一引物在DNA上的結(jié)合位點受到了破壞，從而使多態(tài)性DNA帶完全消失；同時對人工老化的黃瓜種子進行PEG滲調(diào)（圖2），RAPD擴增后發(fā)現(xiàn)，老化3，7，8，14 d的種子擴增出與對照基本相同的帶型，原來只有1～2條條帶的地方也出現(xiàn)了與對照基本相同的帶型，只有老化13 d的經(jīng)PEG滲調(diào)后仍無擴增條帶，可能是種子內(nèi)因和受損程度過大的外因同時作用的結(jié)果。

由圖3可知，利用引物S190分析時發(fā)現(xiàn)，利用人工老化的黃瓜種子進行RAPD擴增，老化4，7，8，9，12，13，14，15 d的種子與對照相比，均無擴增條帶出現(xiàn)，1 d和3 d的種子條帶減少；當(dāng)用PEG滲調(diào)處理以后，所有批次的擴增條帶都出現(xiàn) （圖4），只是老化1，8，13 d的種子約1400 bp處缺失1條條帶，其余與對照基本相同。以上表明，人工老化處理對黃瓜種子的基因組DNA會造成損傷，表現(xiàn)為DNA帶的減少甚至完全消失，而PEG滲調(diào)后，老化程度較輕的黃瓜種子DNA得到了修復(fù)，表現(xiàn)為DNA帶的重新出現(xiàn)，甚至與對照基本相同。利用引物 S475，S300，S1140，S2144擴增也出現(xiàn)了與上述基本相同的情況 （數(shù)據(jù)未顯示）。

3 小結(jié)與討論

已有大量研究資料表明，利用人工加速老化法可以模擬種子的自然老化或劣變過程[12]。人工加速老化處理種子只是加速了種子內(nèi)部的代謝過程，與自然老化相比，并無老化機理上的差異。種子老化會引起其基因組DNA不同程度的損傷。DNA的損傷有以下幾種類型：①堿基的損傷與丟失；②錯誤堿基；③甲基化堿基；④嘧啶二聚體；⑤DNA鏈的斷裂；⑥D(zhuǎn)NA鏈的交聯(lián)[13]。種子內(nèi)損傷的DNA只要在適宜的條件下（如適宜的水分和溫度）就會被種子細胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)所校正和修復(fù)。已有研究資料表明，在引發(fā)處理時對種子的吸水加以適當(dāng)控制，DNA的修復(fù)機制就會被激活[14～15]。其中，滲調(diào)引發(fā)可以使DNA的修復(fù)機制被激活，改善種子的成苗[16]，并使引發(fā)種子在水中的萌發(fā)初期有更合理的代謝平衡[17]。

數(shù)年前，已有人開始從種子中提取DNA用于RAPD分析[1,18]。Robert等認(rèn)為，模板DNA的完整性會影響RAPD帶型。他們以為，質(zhì)量最差的種子會產(chǎn)生最豐富的DNA多態(tài)性，然而，他們的研究結(jié)果卻表明，DNA多態(tài)性出現(xiàn)最多的是室內(nèi)貯藏的種子，而非質(zhì)量最差的人工加速老化的種子[19]。

本試驗中，對人工老化以及滲調(diào)引發(fā)的黃瓜種子基因組DNA進行RAPD分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子經(jīng)過不同時間的人工老化處理后，92條引物中共有22條的擴增產(chǎn)物表現(xiàn)出多態(tài)性，22條引物的多態(tài)性RAPD帶型大多數(shù)都是DNA帶的減少甚至消失，少數(shù)是DNA帶量的減少，亮度減弱。同時利用25%的PEG 6000溶液對老化1～15 d的黃瓜種子進行滲調(diào)引發(fā)24 h，對其基因組DNA進行RAPD擴增，共獲得了16條引物的基因組DNA指紋圖譜。從指紋圖譜來看，經(jīng)PEG滲調(diào)引發(fā)的黃瓜老化種子，RAPD擴增產(chǎn)物基本可以恢復(fù)到老化前的狀態(tài)，但是老化程度過重（如13～14 d），RAPD擴增的產(chǎn)物減少甚至沒有，也就是說，引物在該結(jié)合位點的擴增產(chǎn)物減少或者沒有。老化程度較輕的黃瓜種子（老化1～6 d）經(jīng)PEG滲調(diào)引發(fā)后一般都有相同的帶型，而老化程度較重的黃瓜種子（老化7～15 d）則基本沒有擴增條帶。由此說明，人工老化處理對黃瓜種子的基因組DNA造成了損傷，使某些引物在其基因組DNA上的結(jié)合位點遭到了破壞，從而使DNA帶減弱甚至消失。而PEG滲調(diào)引發(fā)可以在一定程度上激活DNA的修復(fù)機制，使損傷的DNA得到修復(fù)。但是由于DNA的損傷是隨機發(fā)生的，引物在基因組DNA上的結(jié)合位點也是隨機的，也就是說，有的引物的結(jié)合位點被破壞，而有的引物的結(jié)合位點沒有被破壞。但總體來說，老化程度較輕的黃瓜種子PEG滲調(diào)引發(fā)后，引物的結(jié)合位點基本沒有影響，說明結(jié)合位點本來就沒有受損傷，或者即使受了損傷也在滲調(diào)引發(fā)過程中得到了修復(fù)。而老化程度較重的黃瓜種子的損傷DNA即使經(jīng)滲調(diào)引發(fā)也得不到修復(fù)，說明DNA損傷過于嚴(yán)重，或者是核內(nèi)的修復(fù)體系也被破壞了。

圖1 引物S359在人工老化黃瓜種子上的RAPD指紋圖譜

圖2 引物S359在PEG處理黃瓜種子上的RAPD指紋圖譜

圖3 引物S190在人工老化黃瓜種子上的RAPD指紋圖譜

圖4 引物S190在PEG處理黃瓜種子上的RAPD指紋圖譜

總之，黃瓜種子在人工老化過程中其基因組DNA的損傷是隨機發(fā)生的。隨著老化程度的加重，隨機引物在基因組DNA上的特定結(jié)合位點被破壞，表現(xiàn)為RAPD擴增的DNA帶的減少甚至消失。而PEG滲調(diào)引發(fā)對黃瓜種子中損傷的DNA具有一定的修復(fù)作用，表現(xiàn)為DNA帶重新出現(xiàn)或者與對照基本相同，從而建立了黃瓜老化種子基因組DNA的損傷與修復(fù)的RAPD指紋圖譜。但是，DNA損傷和PEG滲調(diào)引發(fā)的機制還需要進一步研究。

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RAPD Studies on Genomic DNA Damages During Artificial Aging and Its Osmoprimed Repair with PEG in Cucumber Seeds

WU Chunlian1,QIAO Aimin2,SUN Min3
(1.School of Life Sciences,China West Normal University,Nanchong,Sichuan 637002; 2.Departure of Horticulture,Zhongkai Agrotechnical College;3.School of Life Sciences,Southwest University)

RAPD was applied to DNA polymorphism analysis of artificial aged and PEG osmoprimed seeds in Cucumber, and the fingerprints of RAPD were established among genomic DNA damages of cucumber seeds.Twenty-two priemrs from 92 were suitable for cucumber seeds of artificial aging and 16 primers from 92 were suitable for cucumber seeds of PEG treatment.A comparative study was made on DNA bands of cucumber seeds of artificial aging and PEG osmoprimed repairment with six primers S190,S300,S359,S475,S1140 and S2144.The results showed that DNA bands of artificial aging seeds were weaker till they disappeared completely,but when they were repaired with PEG,the amplified DNA profile was the same as control or almost the same as the control.Therefore,the fingerprint of RAPD was established among genomic DNA damages of cucumber seeds during artificial aging and its osmoprimed repairment with PEG.

Cucumber seed;Artificial accelerated aging;DNA damage and repair;PEG osmopriming;RAPD

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.14.005

廣東省自然科學(xué)基金資助（NO.001424）

伍春蓮（1976－），女，博士，講師，主要從事細胞與分子生物學(xué)研究，電話：13281952429。E-mail：wcl_xj@163.com

2009-04-09