商陸抗病毒蛋白在植物抗病上的應用

陳國菊 雷建軍 曹必好

（華南農業大學園藝學院，廣東廣州，510642）

商陸抗病毒蛋白在植物抗病上的應用

陳國菊 雷建軍 曹必好

（華南農業大學園藝學院，廣東廣州，510642）

商陸抗病毒蛋白是指商陸屬植物中的核糖體失活蛋白。闡述了商陸抗病毒蛋白的研究歷史、意義、種類和理化性質，對病原菌的抗性、抗病機理及其在植物抗病上的應用情況等，并對它的應用前景作了展望。

商陸抗病毒蛋白 抗病 基因分離 轉基因

1 商陸抗病毒蛋白的概念

商陸抗病毒蛋白 （pokeweed antiviral proteins，PAP），是商陸屬（Phytolacca）植物的不同組織或不同生長階段合成的一類具酶功能的堿性蛋白，屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白 （ribosome-inactivating protein I，RIP），對植物病毒、動物病毒、真菌、細菌有一定的抑制作用[1～6]。

前人對于PAP的研究，多數是以美洲商陸為研究材料，以商陸屬的其他植物為研究材料的很少。事實上，早在1948年，Kassanis B等就從食用商陸葉片中分離和提純了商陸抗病毒蛋白[11]。MoonY H等從葉片中分離PinPAP基因并且將其轉化到馬鈴薯中[12]。

在其他的商陸屬植物中也有這種蛋白的存在，所以pokeweed antiviral proteins,PAP，應該是“商陸抗病毒蛋白”而不是“美洲商陸抗病毒蛋白”。美洲商陸抗病毒蛋白（PamPAP）是指從美洲商陸中分離出來的抗病毒蛋白。

2 PAP的種類

目前從美洲商陸中分離得到數種抗病毒蛋白，統稱為PamPAPs，隨季節和植株部位的不同而形成不同形式。

純化自美洲商陸中的PamPAP有6種：一種是在春季葉片上合成的PamPAP稱為PamPAPI，其相對分子質量為29 kD，等電點為8.1；另一種是PamPAPII，產生于夏季葉片，其相對分子質量為30 kD，等電點為8.3；還有一種是晚夏的時候表達的蛋白，稱為Pam-PAPIII，相對分子質量為30 kD；純化自美洲商陸的種子的PamPAP叫PamPAP-S，相對分子質量為29 kD；而從美洲商陸的根部獲得的PamPAP稱為Pam-PAP-R[1～2，11～12]。此外，以PamPAP-S序列為引物，從種子中獲得核基因組編碼的抗病毒蛋白Pamα-PAP，這個蛋白與PamPAP-S類似但不相同，比PamPAP-S在氨基和羧基端分別多24和9個氨基酸殘基[5]。Lin等將來自美洲商陸生長期葉片cDNA編碼的抗病毒蛋白稱為c-PamPAP[4]。

3 PAP對病原菌的抗性

3.1 PAP抑制植物病毒的活性

自Dugger B M等在1925年報道了美洲商陸汁液抑制黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV）的研究[13]以來，隨后有許多研究者對之進行了抗植物病毒的研究。從目前的報道來看，PAP屬于廣譜性抗植物病毒蛋白。

Chen Z C等報道，純化自美洲商陸葉片中的PamPAP用枯斑寄主測試時，抗5種植物RNA病毒，即TMV、CMV、ALMV、馬鈴薯X病毒（PVX）和馬鈴薯Y病毒 （PVY）；用系統寄主測試時，它能夠抗2種DNA病毒，即花椰菜花葉病毒（CaMV）和非洲木薯花葉病毒 （ACMV），同時還發現，在病毒侵染后再用PamPAP處理，則PamPAP不表現抗病毒活性，說明PamPAP只在病毒侵染的初期阻止病毒的復制[14]。

劉海礁等研究發現美洲商陸愈傷組織的蛋白提取液對TMV具有顯著抗性[15]，為安全生產、高效的植物源抗病毒制劑提供了一定基礎。

3.2 PAP抑制動物病毒的活性

PAP不僅對多種植物病毒具有廣譜抗性，也可以抑制動物病毒活性，如對脊髓灰質炎病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV-1）、I型單純皰疹病毒等動物病毒都有抑制作用[6，11，16～17]。

Zarling J M等報道，PamPAP結合在單克隆抗體上，以CD4+細胞為靶細胞，從而抑制人類免疫缺陷病毒（HIV-1），在CD4+T細胞中的復制使得抗病毒能力提高1000倍[6]，顯然這是一種人工免疫毒素起作用的特例，為開發定向殺死感染病毒細胞的人工藥物提供了很好的啟示。此外，在Vero和Hela細胞中培養的情況下，PamPAP對I型單純皰疹病毒的復制具有抑制作用，這種抑制是由PamPAP緩慢進入受侵染細胞并導致了抑制效果的累積作用[17]。同樣，PAPs也抑制I型單純皰疹病毒[11]。

3.3 PAP抗真菌、細菌以及具有殺蟲活性

PAP除了抗植物病毒和動物病毒活性以外，還對真菌和細菌的活性有一定的抑制作用。Zoubenko O等研究發現在表達PamPAP或無毒性PamPAP突變體的轉基因煙草中可抵抗立枯絲核菌[18]。蔣妮等（2006）測定中國商陸等6種藥用植物粗提物對扶芳藤稠李巢蛾的殺蟲活性，結果表明，中國商陸根的提取物較之其他5種藥用植物具有較好的殺蟲活性，其胃毒活性強，還具有一定的觸殺活性，6種藥用植物中中國商陸最具有研究開發潛力[19]。

4 PAP的抗病機理

PAP作為一類從商陸屬植物中提取的抗病毒蛋白，屬于I型核糖體失活蛋白，實際上是一類同功酶，它們的酶活性可以特異地切斷糖苷鍵，使真核細胞核糖體活性喪失，抑制蛋白質的合成，損傷細胞[20]。

核糖體失活蛋白是一類能夠抑制蛋白質生物合成的蛋白毒素，在酶學分類上歸入糖苷酶[21]，廣泛存在于高等植物中，在真菌和細菌中也有分布。

PamPAP可使美洲商陸核糖體失活，對美洲商陸細胞有潛在的毒性，因此以原位自殺模式（local suicide model）作為美洲商陸中PamPAP的抗病毒機制，同時強調了PamPAP和細胞中核糖體在空間上的分離[22]。寄主核糖體的脫嘌呤和核糖體失活是PamPAP抑制病毒侵染的原因。在T細胞和巨噬細胞中，能夠抑制HIV-1復制的PAP濃度并不影響蛋白質合成，但能夠引起人類HIV-1和植物TMV的基因組RNA的脫嘌呤，由這一結果表明，PAPs的抗病毒活性也包括對病毒本身RNA的脫嘌呤作用[6，12～23]。

PAP具有不同的功能區：現已證明在成熟的PAP N-端第170～183個氨基酸為一個活性區域，保守性很強，其主要功能是對病毒產生抗性；在成熟的PAP C-末端1～25個氨基酸處的區域，主要功能是脫去rRNA的特異位點上的腺嘌呤，使其蛋白質合成受阻，致使細胞死亡。試驗也證明，缺少C-末端1～25個氨基酸的PAP喪失了對寄主細胞的毒性，即不阻礙該細胞蛋白質的正常合成，但是仍然賦予該細胞對侵入病毒的抗性，而將活性區的某一個氨基酸突變之后，如將第176位的氨基酸E變成V，即可使其失去活性，也就喪失了對病毒的抗性[24]。PAP的毒性活性區與寄主細胞的毒性區彼此分離，因此可以通過基因改造，去其細胞毒性區而保留抗病毒活性區，即可發揮其實際利用價值。

PAP的細胞毒性已被許多學者所注意，他們設計用這類毒素來殺死癌細胞和腫瘤細胞[6，11，17]。其原理是通過一些特定的蛋白交聯劑，PAP與某些癌細胞和腫瘤細胞或特定抗原的抗體相結合，可定向地殺死體內的癌細胞和腫瘤細胞。

5 PAP在植物上的應用

5.1 用于制備免疫毒素（Immunoty oxins）

從商陸屬植物中分離到一系列抗病毒蛋白（PAPs）以及一些抗真菌蛋白，可以抑制多種植物病毒、真菌等活性。利用這一特性，可以制備免疫毒素用于植物病害的防治。

Dore J M等 （1993）采用PCR技術克隆了Pam-PAP的開放閱讀框（ORF），研究了抑制真核生物的翻譯過程，但對大腸桿菌無毒性的兩個PamPAPI序列僅有1和2個位點發生突變，突變位點的氨基酸可能參與原核糖體的識別，因此，這兩個PamPAPI突變體可用于構建免疫病毒[25]。

5.2 PAP基因克隆與表達

目前采用基因工程技術，已經成功克隆和表達了不同類型的PAPs。在Gene Bank中登錄的PAP基因已經超過20個。

通過不同的引物設計，從商陸屬植物中克隆得到了不同的商陸抗病毒蛋白基因，對其進行序列分析和表達研究[4，26～27]。劉迎芳等從美洲商陸種子中新發現一種抗真菌蛋白基因（Pa-AFP），將它轉化到大腸桿菌中，融合蛋白被大量表達[28]。

5.3 轉PAP基因作物

將PAP基因導入植物體內，受體可以產生對多種病毒的抗性，避免目前絕大多數抗病毒轉基因植物只抗單個病毒而對多種病害沒有抗性的局面。目前已通過轉基因技術將不同的PAP基因導入到馬鈴薯、煙草、辣椒、番茄、油菜、水稻、草坪草、小麥和玉米等植物中，所獲得的轉基因植株，所抗病毒及其他病原菌的種類也比較多。但是有些PAP基因導入植物，轉基因植株會有一些不良反應發生。

轉PamPAP基因的煙草和馬鈴薯植株表現出對PVX、PVY和CMV機械接種病毒的抗性，同時也發現轉基因植株較正常植株生長矮小[29]；而轉Pin-PAP馬鈴薯植株表現出對PVX,PVY和馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）等的抗性[10]。陳定虎等對PamPAP的基因進行缺失改造后，獲得的轉基因小麥、玉米、煙草、棉花分別對大麥黃萎病、玉米矮花葉病、煙草花葉和棉花黃萎病有不同程度的抗性[30]。陳國菊等從中國商陸中克隆的缺失無毒型PacPAP基因轉化辣椒和番茄，轉基因辣椒植株抗TMV和CMV，轉基因番茄株系達到抗病級別[31～32]。Dai W D等將PamPAPC（成熟PamPAP C-端缺失25個氨基酸殘基）、PamPAP-Y（將PamPAP123位的酪氨酸變成了丙氨酸）和PamPAPII分別轉化到草坪草中，獲得了抗核盤菌和立枯絲核菌的轉基因植株，其中，轉Pam-PAP-Y的植株生長狀況良好而且抗病性穩定，轉PamPAPII的植株生長勢弱而且有一定程度的矮化現象 [33]。

6 展望

PAP作為一類具多種功能（抗植物病毒、抗動物病毒、抗真菌等）的蛋白，已引起人們的高度重視。

首先，在抗植物病毒、真菌等方面，由于還沒有有效的抗病毒化學制劑，病原性的轉基因工程植物存在一定的環境風險，因此，作為非病原的一類抗病毒蛋白基因，用作抗病毒的轉基因材料，具有一定的優勢。但是，PAP基因直接轉基因存在一定的細胞毒性，因此，可以通過基因改造，去其細胞毒性區而保留抗病毒活性區，發揮其實際利用價值。

其次，PAP對多種動物病毒有抑制作用，特別是對HIV，使其在制備免疫毒素方面表現出了巨大的醫療潛力。

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Pokeweed Antiviral Proteins from Phytolacca and Its Application to Controlling Diseases in Plant

CHEN Guoju,LEI Jianjun,CAO Bihao

Pokeweed antiviral protein is a ribosome-inactivating protein inplants.The following topics are reviewed such as study history and significance of pokeweed antiviral proteins(PAP)fromThe correction of PAP concept,PAP kinds and physical and chemical characters,resistance to diseases,resistance mechanism,application to controlling diseases in plants,the future prospects are discussed.

Pokweed antiviral proteins;Disease-resistance;Gene isolation;Transgenic plants

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.002

本研究獲廣東省自然科學基金項目（32293）資助

陳國菊（1967-），女，博士，副教授，主要從事蔬菜育種與生物技術研究

雷建軍（1957-），通信作者，男，華南農業大學教授，博士，主要從事蔬菜育種與生物技術研究

2009-07-02