高羊茅再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

楊　揚(yáng)　何勝江　吳　凱　李興美　付婷婷

摘要高羊茅在我國(guó)有著廣泛的種植面積，是多年生冷季型牧草和草坪草。介紹了高羊茅的再生體系，從它的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化目標(biāo)、影響因素、生物安全問題等方面綜述了高羊茅的外源基因轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞高羊茅；再生體系；遺傳轉(zhuǎn)化；影響因素；展望

中圖分類號(hào)S688.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)01-0042-03

高羊茅又名葦狀羊茅，屬于禾本科羊茅屬，原產(chǎn)于歐洲西部，我國(guó)在20世紀(jì)70年代引進(jìn)，現(xiàn)已是世界溫帶地區(qū)建立人工草地和補(bǔ)播天然草場(chǎng)的重要草種[1]。高羊茅是多年生疏叢型禾草，其具有耐旱耐濕耐熱、生長(zhǎng)迅速、再生性強(qiáng)等特點(diǎn)，隨著我國(guó)人工草地建植的不斷發(fā)展，其建植面積正在不斷地?cái)U(kuò)大。

高羊茅在我國(guó)具有廣泛的氣候和土壤環(huán)境適宜性，大部分地區(qū)均可種植。它屬于多年生冷季常綠型，生長(zhǎng)期達(dá)8～10個(gè)月，可充分利用太陽(yáng)輻射，耐瘠薄，在黏至砂質(zhì)土壤上均表現(xiàn)良好。但是，高羊茅在抗旱性、耐寒性方面還需要進(jìn)一步提高。利用常規(guī)育種技術(shù)耗時(shí)周期長(zhǎng)，效率差，存在很多的局限性。利用基因工程技術(shù)即將抗逆功能基因有目的、有針對(duì)性地導(dǎo)入特定品種的愈傷組織或原生質(zhì)體，獲得改良的轉(zhuǎn)基因植物[2]，如利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗旱節(jié)水、耐寒的高羊茅新品種就是目前研究的熱點(diǎn)。

建立高效的組織培養(yǎng)體系是植物遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件，高羊茅組織培養(yǎng)方面的研究開始于20世紀(jì)80年代，1979年Lowe和Conger從高羊茅成熟種子胚成功地誘導(dǎo)愈傷組織并得到再生植株。此后，人們通過花粉囊培養(yǎng)、幼穗培養(yǎng)、從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞獲得原生質(zhì)體的培養(yǎng)和成熟種子誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)等都獲得了再生植株。

1高羊茅再生體系

高羊茅等羊茅草種的組織培養(yǎng)開始于20世紀(jì)70年代，Dale首先從高羊茅的分生組織頂端培育出小植株[3]，其后，隨著研究的不斷深入，愈傷組織再生系統(tǒng)、懸浮細(xì)胞再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體再生系統(tǒng)等各種途徑的高羊茅再生體系相繼建立。

1.1愈傷組織再生系統(tǒng)

對(duì)于單子葉植物高羊茅來說，選用愈傷組織再生系統(tǒng)是最為理想的，因?yàn)閱巫尤~植物懸浮系的建立和原生質(zhì)體的再生十分困難，而由器官直接分化再生植株難度更大[4]。目前通過對(duì)高羊茅不同外植體（如成熟種子、成熟胚、幼胚、幼穗、節(jié)外植體、葉片基部的切片、分生組織及花梗組織等）的誘導(dǎo)已經(jīng)獲得了愈傷組織并建立了相關(guān)的再生體系[5]。

基因型是影響高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的一個(gè)重要因素。Eizenga等[6]在對(duì)高羊茅研究過程中發(fā)現(xiàn)不同品種之間愈傷組織誘導(dǎo)率及其再生頻率有顯著差異，而且產(chǎn)生愈傷組織最多的基因型未必再生植株最多。Bai等[7]對(duì)美國(guó)多個(gè)高羊茅常見品種進(jìn)行了比較研究，愈傷誘導(dǎo)率變幅在16.7％～58.8％，分化成苗率1％～22％，并且發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率低的品種，愈傷組織再生頻率不一定低。王維飛在研究高羊茅愈傷組織及植株再生過程中認(rèn)為不同基因型因其內(nèi)源激素是不同的，故基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)存在影響。

在常用的植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基類型中，高羊茅組織培養(yǎng)采用最多的基本培養(yǎng)基是MS。將不同的植物激素、有機(jī)物或其他物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中可以改變愈傷組織的誘導(dǎo)率。與其他禾本科草不同，高羊茅成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織需要較高濃度的植物生長(zhǎng)物質(zhì)2，4-D[8]。2，4-D是誘導(dǎo)高羊茅外植體形成愈傷組織的關(guān)鍵因素[4]，最佳2，4-D濃度是5～9mg／L[7，9]，高于12mg／L或低于2mg／L則對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有強(qiáng)烈抑制作用[10]。

1.2胚性懸浮細(xì)胞再生系統(tǒng)

禾本科植物懸浮細(xì)胞的植株再生比較困難，高羊茅也不例外[11]。胚性懸浮細(xì)胞系作為分離原生質(zhì)體的來源，已經(jīng)廣泛用于體細(xì)胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化[12]，高羊茅胚性懸浮細(xì)胞系的建立，為高羊茅原生質(zhì)體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)極好的體系[13]。相較于愈傷組織再生系統(tǒng)，由高羊茅胚性懸浮培養(yǎng)細(xì)胞再生植株的工作在20世紀(jì)80年代后期已取得成功[14]，Dalton等[15]采用碳化纖維法轉(zhuǎn)化高羊茅細(xì)胞懸浮物，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在已報(bào)道的高羊茅懸浮細(xì)胞再生分化的研究中，大多存在著綠苗再生頻率低、白化苗發(fā)生率高的問題，胡張華等[16]在試驗(yàn)過程中認(rèn)為用經(jīng)2.5mg/L CuSO4·5H2O篩選出的胚性愈傷組織在短期內(nèi)建立穩(wěn)定的高質(zhì)量胚性懸浮細(xì)胞系是研究成功的前提；而將懸浮細(xì)胞進(jìn)行高滲處理并結(jié)合高濃度瓊脂培養(yǎng)是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[16]。

1.3原生質(zhì)體再生系統(tǒng)

自從1960年英國(guó)學(xué)者Cocking用酶法首次從番茄根尖分離出大量有活性的原生質(zhì)體，并通過培養(yǎng)再生細(xì)胞壁以來，人們對(duì)植株原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)進(jìn)行了廣泛地探索[17]。原生質(zhì)體可用于直接基因轉(zhuǎn)移和融合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株和體細(xì)胞雜種[18]。據(jù)研究報(bào)道，從高羊茅細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系分離的原生質(zhì)體可以分成4類，即含有大淀粉粒（5～10μm）的具液泡原生質(zhì)體、含有小淀粉粒（2μm）的具液泡原生質(zhì)體、只具液泡的原生質(zhì)體和沒有可見液泡的小而細(xì)胞質(zhì)稠密的原生質(zhì)體[19]。Takamizo[20]等將碘乙酰胺失活的高羊茅原生質(zhì)體與非形態(tài)發(fā)生的意大利黑麥草原生質(zhì)體電融合，并再生獲得了若干綠色植株[20]。

2外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化

2.1轉(zhuǎn)化方法

迄今為止，利用基因工程技術(shù)把外源基因?qū)胫参锛?xì)胞從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)主要包括PEG法、電激法、硅碳纖維法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。Wang等[21]1992年用PEG法以懸浮細(xì)胞系為受體，獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Bar基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅；Ha等[22]1992年以胚性細(xì)胞為受體通過電激融合法獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Gus基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅；Dalton等[23]1998年首次采用硅碳纖維轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高羊茅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，獲得了轉(zhuǎn)基因植株；Spangenberg等[24]1995年通過基因槍法以胚性懸浮系為受體獲得了轉(zhuǎn)Gus基因的高羊茅[24]；Bettany等[25]2003年通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以胚性懸浮細(xì)胞為受體獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Gus基因的2個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系的高羊茅[25]。

2.2轉(zhuǎn)化的主要目標(biāo)

早期的高羊茅轉(zhuǎn)基因研究的主要是為了建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，因此所轉(zhuǎn)的外源基因只局限于選擇基因Hpt（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）和Bar（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）以及報(bào)告基因Gus（葡糖苷酸酶基因）[26]。目前的轉(zhuǎn)化目標(biāo)主要包括以下幾個(gè)方面。

2.2.1改良高羊茅的品質(zhì)。作為牧草型用的高羊茅，提高它的干物質(zhì)消化率以利于動(dòng)物吸收，從而改善動(dòng)物的適口性和其品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，采用基因工程育種技術(shù)能比傳統(tǒng)的育種技術(shù)更快的達(dá)到目的。Wang等[27]在2001年將向日葵清蛋白SFA8與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL轉(zhuǎn)入了高羊茅，使轉(zhuǎn)基因植株中SFA8蛋白含量占總?cè)艿鞍椎?.2%，比未轉(zhuǎn)基因植株的0.01%提高了許多。SFA8含有23%的甲硫氨酸和半胱氨酸，這2種含硫氨酸都屬于反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中最為限制性的必需氨基酸，將此基因?qū)肽敛菪透哐蛎磉_(dá)產(chǎn)生含硫氨基酸豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)率具有重要意義。

2.2.2獲得抗除草劑性能。隨著城市經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，草坪草在城市環(huán)境美化、綠化扮演著越來越重要的角色，化學(xué)除草劑因此得以廣泛地應(yīng)用。目前使用的化學(xué)除草劑大多屬于高毒高污染的化學(xué)藥品，它的大量使用將會(huì)嚴(yán)重污染土壤、地下水，揮發(fā)到空氣中還可污染空氣，同時(shí)還會(huì)破壞生態(tài)系統(tǒng)。生物除草劑由此誕生，抗除草劑基因是其重要組成部分。抗除草劑基因的表達(dá)以其特有的除草劑抗性特征，在植物基因工程技術(shù)中得以廣泛應(yīng)用，在很多遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中簡(jiǎn)化了篩選過程。利用抗除草劑基因作為遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記基因的研究報(bào)告有很多。Kuai等[28]1999年獲得具有可育性的轉(zhuǎn)基因高羊茅，對(duì)除草劑Glufosinate ammonium 有明顯的抗性。在以培育抗除草劑植物為目的的研究中，Wang等[29]1992年用抗除草劑基因（bar）轉(zhuǎn)化高羊茅原生質(zhì)體。

2.2.3提高抗逆性。植物的抗逆性是十分復(fù)雜的性狀，包括抗寒性、抗旱性、耐鹽性等，是多個(gè)基因來參與調(diào)控的。抗逆基因的分離、克隆和轉(zhuǎn)化一直都是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)分離出大量相關(guān)的基因，如抗寒有關(guān)的Mn-SOD基因等、抗旱有關(guān)的擬南芥CBF基因等、耐鹽有關(guān)的脯氨酸合成酶基因等。提高高羊茅的抗旱性，既可以降低它作為草坪草的管理費(fèi)用，又能使它在干旱地區(qū)得以廣泛種植。任偉[30]通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)DREBIA基因轉(zhuǎn)化高羊茅獲得了抗旱性牧草株系。梁蕊芳[31]利用基因槍法將NHX1、CBF耐逆相關(guān)基因?qū)敫哐蛎┇@得了相關(guān)的抗性植株。

2.2.4提高抗病害性。病蟲害普遍存在于高羊茅的生產(chǎn)中，病蟲害多、分布廣，嚴(yán)重影響生產(chǎn)。化學(xué)藥品的過度使用使得各病蟲害的耐藥性加強(qiáng)，而傳統(tǒng)的育種技術(shù)周期過長(zhǎng)，無法滿足目前的生產(chǎn)需求。目前的抗蟲基因主要包括植物外援凝集基因、蛋白酶抑制基因和Bt基因。抗病毒基因的技術(shù)路線有：導(dǎo)入病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)基因；利用病毒的衛(wèi)星RNA(Satellite RNA，Sat- RNA)；利用病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，特別是復(fù)制酶—replicase 基因；利用人工構(gòu)建的缺損干擾顆粒(Defective interfering particle)；利用植物本身編碼的抗病毒基因和利用動(dòng)物中的干擾素(Interferon)基因；利用反義RNA 技術(shù)；利用中和抗體法技術(shù)；設(shè)計(jì)核酶剪切病毒RNA 等。在這些技術(shù)路線中，導(dǎo)入CP基因是目前最為成功的一種[32]。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

2.3.1篩選方法的選用。目前，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的選擇標(biāo)記大多用抗生素作為篩選標(biāo)記基因，主要有以下類型：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NptII基因，具有抗卡那霉素或G418 特性)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hpt基因，具有抗潮霉素特性)、除草劑轉(zhuǎn)移酶基因(Bar基因，提供對(duì)除草劑Basta的抗性)等[33]。在高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化中，研究人員大多采用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選，簡(jiǎn)單不連續(xù)篩選時(shí)，植株再生最多，但導(dǎo)致大量逃逸植株的產(chǎn)生；而采用低濃度潮霉素連續(xù)篩選，雖然一些未轉(zhuǎn)化愈傷組織能夠存活和生長(zhǎng)，但不能再生植株，因而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)最多且沒有逃逸[34]。

2.3.2抗生素的使用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化中已獲得了成功，在篩選轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中需要加入抗生素以殺滅農(nóng)桿菌。高羊茅的研究中常使用頭孢霉素與羧芐青霉。吳關(guān)庭等[35]在研究抗生素對(duì)高羊茅胚性愈傷組織生長(zhǎng)與分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)頭孢霉素明顯抑制愈傷組織生長(zhǎng)，而濃度低于500mg／L的羧芐青霉素能促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)；2種抗生素對(duì)愈傷組織分化均有抑制作用，但羧芐青霉素的抑制作用要比頭孢霉素小。

2.3.3培養(yǎng)時(shí)間。采用胚性細(xì)胞懸浮物為再生系統(tǒng)時(shí)，懸浮物培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高羊茅再生植株影響明顯。Kuai和Morris (1995)[41]研究表明，用于分離原生質(zhì)體的細(xì)胞培養(yǎng)物的繼代保存時(shí)間和分離前的繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Gus基因的瞬間和穩(wěn)定表達(dá)有顯著影響。隨著懸浮培養(yǎng)物繼代保存時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面，正如前面所指出的那樣，植株再生能力下降，白苗增多，另一方面，Gus基因瞬間表達(dá)水平和穩(wěn)定表達(dá)頻率逐漸降低。使用從繼代培養(yǎng)3～4d的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體，其Gus基因瞬間表達(dá)水平最高，而使用從繼代培養(yǎng)1d和7d的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質(zhì)體，其Gus基因瞬間表達(dá)水平還不到其1/2。原生質(zhì)體分離前的繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Gus基因瞬間表達(dá)的影響與細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)率和蛋白合成速率密切相關(guān)。

2.3.4植物激素。激素是細(xì)胞、組織培養(yǎng)中除了遺傳因素之外非常重要的因素，并且非常難掌握。對(duì)禾本科草類而言，起主要作用的是生長(zhǎng)素類、分裂素類和脫落酸類，應(yīng)用于高羊茅的也主要是這3類激素。高羊茅在組織誘導(dǎo)中需要高濃度的2，4－D，最適濃度為9.0mg/L[36]；6－BA的使用濃度為1.0～3.0mg/L[37]；在高羊茅懸浮細(xì)胞系的建立及綠色植株的高頻再生的研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的ABA對(duì)高羊茅成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響，以ABA為2.0mg/L時(shí)的誘導(dǎo)率最高，且可有效抑制胚芽和根的生長(zhǎng)，顯著提高其成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率[16]。

2.3.5污染及白化苗問題。高羊茅在組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他草種，且愈傷組織誘導(dǎo)率一直很低。后有研究者發(fā)現(xiàn)這與高羊茅體內(nèi)共生的頂孢霉素真菌有關(guān)。Samposon于1933年首次報(bào)道了禾本科牧草葉鞘組織內(nèi)有真菌存在。李劍等[40]在檢測(cè)高羊茅種子內(nèi)生真菌的研究中，所測(cè)的7個(gè)樣品有4個(gè)品種都含有內(nèi)生真菌，且獵狗5號(hào)品種帶菌率達(dá)80%。現(xiàn)在研究人員常采用不同的種子處理方法以減少內(nèi)生真菌對(duì)組織誘導(dǎo)的影響。高羊茅再生植株白化現(xiàn)象在組織培養(yǎng)中普遍存在，問題很突出。在Rajoelina等[38]1990年的研究中，15%的高羊茅愈傷組織完全再生白化植株，另有18%的愈傷組織同時(shí)再生白苗和綠苗。Takamizo等[39]1990年再生獲得188個(gè)原生質(zhì)體來源的高羊茅植株，其中白化苗多達(dá)145個(gè)，占77.1%。

2.4遺傳轉(zhuǎn)化生物安全問題

作為牧草型用的高羊茅，在日常使用過程中，由于缺乏適度修剪常導(dǎo)致開花結(jié)實(shí)，花粉通過自然或人為因素的傳播引發(fā)潛在的生物安全問題，特別是抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入存在向野生雜草轉(zhuǎn)移的可能。但不少研究者認(rèn)為草類植物異交率很低，種間雜交情況很少[42]。作為草坪型用的高羊茅在城市綠化中通常是通過適當(dāng)?shù)男藜暨M(jìn)行養(yǎng)護(hù)管理，不會(huì)存在開花結(jié)實(shí)的問題。無論怎樣，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全仍然是全世界普遍關(guān)注的問題之一，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)主要集中在2個(gè)方面，一個(gè)是環(huán)境安全性，另一個(gè)是食品安全性。目前很多國(guó)家都已制定了各自對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的相關(guān)管理法規(guī)，對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)和監(jiān)控。

3展望

高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化是21世紀(jì)草坪草和牧草轉(zhuǎn)基因研究的一個(gè)熱點(diǎn)。自20世紀(jì)80年代以來，我國(guó)農(nóng)業(yè)生物基因工程技術(shù)迅速發(fā)展，到目前為止，高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)建立了多套轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，取得了較大進(jìn)展。高羊茅作為我國(guó)主要應(yīng)用的草坪草和牧草草種之一，仍存在巨大潛力空間，但所需的草種基本依靠國(guó)外進(jìn)口，培育適合我國(guó)本土環(huán)境生長(zhǎng)需求的新品種勢(shì)在必行。雖在研究過程中面臨種種困難，但隨著農(nóng)業(yè)生物工程基因技術(shù)的發(fā)展，問題將逐一解決。迄今為止，高羊茅已有子代轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性的研究，而大部分其他種類還僅局限于轉(zhuǎn)化研究階段，這也將極大促進(jìn)高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化的更快速發(fā)展。

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