植物功能基因組的主要研究方法及其應用

王　丹　楊　宇

摘要概述了植物基因功能的主要研究方法，并論述了主要技術如cDNA微陣列與基因芯片技術、反向遺傳學技術、表達序列標簽(EST)、蛋白質組學、生物信息學等及其應用。

關鍵詞植物功能基因組；方法；應用

中圖分類號Q943文獻標識碼B文章編號 1007-5739(2009)01-0277-02

基因組學(genomics)指對所有基因進行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學[1，2]。許多生物全基因組的破譯，使基因組學的研究有了一次質的突破：從結構基因組學開始過渡到功能基因組學。結構基因組學(structural genomics)是通過基因作圖、核苷酸序列分析以確定基因組成、基因定位的一門科學。功能基因組學(functional genomics)代表基因組分析的新階段，被稱為后基因組學(post genomics)，旨在利用結構基因組學豐富的信息資源，應用高通量、大規模的實驗分析方法，結合統計和計算機分析來研究基因的表達、調控與功能，基因間、基因與蛋白質、蛋白質與底物、蛋白質與蛋白質之間的相互作用以及生物的生長、發育等規律[3]。

傳統的遺傳學的方法已不能適應現在基因組學的發展，cDNA微陣列(cDNA micro-array)和基因芯片(gene chip)法、反向遺傳學、表達序列標簽(expressed sequence Tag，EST)、蛋白質組學、生物信息學等方法相繼誕生，為基因組學的研究奠定了堅實的基礎。

1cDNA微陣列與基因芯片法

cDNA微陣列和基因芯片都是基于Reverse Northern雜交以檢測基因表達差異的技術。二者的基本原理是利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相支持物上固定成千上萬個cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光標記的靶DNA進行雜交，然后用相應的檢測系統進行檢測，根據雜交信號強弱及探針的位置和序列，即可確定靶DNA的表達情況以及突變和多態性的存在。該技術優點在于可以同時對大量基因，甚至整個基因組基因的表達差異進行對比分析。

1.1基因表達水平的檢測及表達圖譜的構建

基因芯片技術可以清楚地直接快速定量檢測出細胞內幾個拷貝到幾個數量級拷貝的轉錄產物，而且還可以檢測出外界因素誘導下基因表達水平變化[4]。由于微陣列技術可以同時在同一水平下大規模地、定量地檢測，因而可以檢測出目的基因在不同器官中的表達差異，也能檢測出同一器官在不同時期的表達差異，并在此基礎上繪制相關的表達圖譜，以找出基因型和表現型之間的關系，有助于全面了解基因的表達狀況[5]。

1.2功能相關基因的檢測及新基因的發現

通過對受檢樣品表達圖譜的成對比較，可以建立性狀與基因的可能聯系，鑒別目標性狀基因；也可識別特定生理或代謝途徑中相互作用的相關基因群。構建cDNA文庫，對野生型和突變體的植株進行雜交篩選，發現其差異表達序列后，從文庫中找出相應的克隆，以判斷它是否是新的基因[6]。

1.3轉基因的檢測

采用基因芯片技術對轉基因作物中常見的啟動子、終止子和選擇標記基因等多個外源基因進行檢測，可以建立快速、準確的轉基因作物篩選鑒定技術，可實現對DNA的準確、快速、大信息量的檢測。

2反向遺傳學(reverse genetics)

傳統的遺傳學或稱為正向遺傳學(forward genetics)主要研究自發或誘變突變體中某一突變性狀的遺傳行為。而反向遺傳學(reverse genetics)是相對正向遺傳學而言的，是在基因功能序列已知的基礎上分析研究基因功能，一般通過創造功能喪失突變體來研究突變所造成的表型效應，并推測在生物體內基因的作用。

2.1基因陷阱(Gene trap)

基因陷阱是新近發展起來的一種反向遺傳學方法，它主要依靠報道基因的隨機插入來產生融合轉錄物或融合蛋白，通過檢測報道基因而推知基因及其功能。目前已發展了3種不同的陷阱系統，即增強子陷阱、啟動子陷阱和基因陷阱。它們之間最大的不同體現在報道基因重組體的組成和所插入基因組的位置上。基因陷阱的優勢在于它只在表達水平上定位基因，細胞基因本身的轉錄和表達不受影響，所以可檢測功能上多余的基因，也可檢測在基因表達多個水平上都有作用的基因，或低水平表達的重要基因，而以前的功能基因組學的方法對這些基因都是無法確定的。

2.2TILLING技術

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向誘變基因組局部突變技術，其基本原理是：誘變實驗對象并提取DNA，把多個待測樣品的DNA混合在一起進行PCR，通過變性和復性過程得到異源雙鏈。如果樣品發生突變，那么形成的異源雙鏈中必定含有錯配堿基。利用特異性的內切核酸酶識別攜帶了錯配堿基的異源雙鏈，并在錯配處切開雙鏈，最后進行電泳檢測試驗結果。TILLING作為一種全新的反向遺傳學研究方法已經用于多種植物及作物中，如擬南芥、玉米、水稻等。以美國為首的北美實驗室借助TILLING技術，聯合啟動了擬南芥菜TILLING項目，直接推動了擬南芥功能基因組學項目的建立。該項目在立項的第1年就為擬南芥研究者們提供了超過100個基因上的1 000多個突變位點。隨著各種生物基因組計劃的深入研究，相信TILLING技術將會得到更加廣泛的應用。

2.3RNA干涉技術(RNAi)

RNA干涉是指細胞內的RNAi被內、外源雙鏈RNA(dsRNA)激活，高度特異地抑制同源基因表達的現象，是真菌、動物、植物等大多數真核生物中普遍存在的一種防御反應。RNAi已成功地應用于單個基因和基因家族中的多個成員的沉默，植物中運用轉基因所形成的RNAi可以遺傳到下一代，產生基因表達效應較低的轉基因植物，導致植物表現出相應的缺失表型。因此，RNAi技術具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，已成為功能基因組學的一種強有力的研究工具。

3表達序列標簽(EST)

表達序列標簽(EST)是指從不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑取克隆，對其進行大規模測序所獲得的部分cDNA的5′或３′ 序列，一個EST對應于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長度一般為300～500bp。近幾年來，EST已經成為分離與克隆新基因及基因功能研究的一個行之有效的手段。然而只有少數模式植物測定了基因組序列，在大基因組的植物無法進行全序列測定的情況下，EST已經成為一種進行基因序列比較，發現和鑒定表達基因的最快的途徑[7]。由于EST代表著一段表達的基因序列，可與公共數據庫中的基因進行“電子雜交”(electric hybridization)，進而可以從理論上推測其所代表的基因的功能，因此可部分替代基因組成為科學研究的資源或作為全基因組研究的補充[8，9]。功能基因在進化過程中具有保守性，根據序列同源性可由數據庫中大量已知EST的功能來推測未知EST的功能。

4蛋白質組學(Proteomics)

蛋白質組學表示基因組編碼的蛋白質的全部集合。基因表達的產物是蛋白質，但基因和蛋白質之間也不是一一對應的關系，蛋白質翻譯后還要經過修飾、加工、細胞定位或與其他蛋白質相互作用才具有生物功能，因而隨著后基因組學時代的到來，對蛋白質功能的研究必將會從對特定蛋白質的研究上升到對生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式的研究，即蛋白質組學的研究。近幾年來，蛋白質芯片技術(protein chip)的出現給蛋白質組學研究帶來了新思路。這種技術在體外條件下進行操作，并直接檢測目標蛋白質，不需要酵母作為中介，突破了酵母雙雜交系統技術的局限性，因此必將成為全新的研究蛋白質相互作用的理想工具。

5展望

綜上所述，植物功能基因組學已經取得了一定進展，上述研究方法也只是功能基因組學研究中的一部分，各種方法都各有側重點也有各自的優缺點，可以相互輔助。基因組研究的深入和國際合作的加強，現有的研究手段將會不斷完善和加強，也將會不斷研發出新的研究技術，數據庫系統也將會更趨豐富和共享度會更高，最終研究清楚植物基因組的結構及功能。目前利用功能基因組學的方法進行植物體發育過程中基因功能的研究，植物體內致病基因和程序性死亡有關基因的研究等還很少，這也為植物功能基因組的研究提供了更為廣闊的應用空間。相信植物功能基因組研究方法的應用將會大大促進疾病治療的研究，植物抗病毒研究的發展，也相信植物功能基因組研究方法在各研究領域的廣泛應用將為其轉化成生產力打下堅實的基礎，為農業發展做出更大的貢獻。

6參考文獻

[1] 師科榮，王愛國.功能基因組學的研究方法][J].生物技術通訊，2002，13(4)：301-304.

[2] 李偉，印莉萍.基因組學相關概念及其研究進展[J].生物學通報，2000，35(11)：1-3.

[3] 莊金秋，賈杏林.功能基因組學研究進展[J].動物醫學進展，2004，25(4)：32-36.

[4] 于玲，王萊，牛吉山，等.植物功能基因組研究進展[J].西北師范大學學報(自然科學版)，2003(39)：104-116.

[5] 樊金娟，趙開軍，徐正進.cDNA微陣列技術在植物功能基因組學研究中的應用[J].生物技術通報，2004(3)：26-29.

[6] 張勝，馮志敏.基因芯片技術及其應用[J].河南科技，2005(5)：26-27.

[7] 張勇.植物功能基因組學研究[J].河西學院學報，2005，21(2)：36-39.

[8] 許占友，常汝鎮，邱麗娟，等.大豆表達序列標記(EST)研究進展[J].大豆科學，2000，19(2)：165-173.

[9] 王澤亮，林善枝，張志毅，等.植物功能基因組學研究技術及其在林木中的應用[J].植物生理學通訊，2005，41(4):413-418.