厚皮甜瓜遺傳多樣性的ＳＳＲ分析

趙　娜　周　晶　楊文才　沈火林　譚　芳　郭　爽　王銀磊

摘要：采用61對SSR特異引物對46份厚皮甜瓜材料進行分析，其中52對擴增出條帶，47對引物具有多樣性，擴增帶分子量在150～1500bp，187條譜帶中154條譜帶具有多態性。多態率占82.35％，平均每個引物可擴增出3.60條帶。同時，對材料網紋、果形、單果質量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等12個性狀進行了田間調查，經過phylip軟件和NTSYS軟件分析后，計算出材料間遺傳距離，并做出SSR分子標記和性狀2個聚類圖。結果顯示，46份材料的遺傳距離在0.0188～1.2119，而單一性狀氣味、果皮顏色、果肉顏色和表面網紋的遺傳距離都小于0.1，十分接近；2種聚類分析結果存在較大差異。這與供試材料的親緣關系十分復雜，大部分材料來源相近，具有相同的親本，和回交親本存在一定關系。

關鍵詞：甜瓜；遺傳多樣性；遺傳距離；SSR

甜瓜(Cucumis melo L.)屬葫蘆科(Cueurbitaceae)甜瓜屬(Cueumis)異花授粉植物。在世界各地廣泛種植，是全球十大水果之一，其種質資源和變異類型極其豐富。1859年法國分類學家Naudin首次將甜瓜分為10個族。我國通常把甜瓜分為厚皮甜瓜與薄皮甜瓜2類，其中厚皮甜瓜是我國保護地和西北地區經常栽培的高效經濟作物之一。SSR(simple sequence repeat)即簡單序列重復，通常又稱為微衛星，其最大特點是檢測的位點多態性水平較高。而且重復性較好。2007年，程振家、王懷松等利用AFLP法分析了甜瓜的遺傳多樣性，將供試材料分成了兩大類群，即厚皮甜瓜類群和薄皮甜瓜類群，并進一步將厚皮甜瓜類群分成了4個亞類，與甜瓜傳統分類結果基本一致。2006年，盛云燕、欒非時等用SSR分析了甜瓜的遺傳多樣性，并用NTSYS軟件的立體旋轉模擬分析和聚類分析2種方法對結果進行分析，結果基本與形態學分類相似。本研究的目的是利用SSR分子標記技術并結合田間性狀的觀察，研究厚皮甜瓜的遺傳多樣性，明確供試材料間的遺傳距離，了解材料間遺傳差異，為甜瓜育種中的親本選配以及雜交育種提供理論參考。

1材料和方法

1.1試驗材料

本試驗共收集了46份厚皮甜瓜育種材料(自交系)，見表1，具體性狀表現參考表3。試驗材料于2007年2月在溫室播種，4月2日定植大棚，每個材料定植20株，植株坐果后隨機選取10株記載果實性狀等表型，并提取DNA。

1.2試驗方法

利用61對SSR特異引物對表1中的材料進行研究。引物序列參見Danin-Poleg、Gonzalo、張紅和Fazio等的文章，引物由北京三博遠志生物有限公司提供，Taq酶和dNTP購自北京天根生物技術公司，PCR-100由Bio-Rad公司生產。

1.2.1DNA提取從每份材料中隨機選取植株10株，混合取樣，以幼嫩的葉片為材料提取甜瓜基因組DNA。提取方法采用CTAB小量法。提取完畢后利用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度。并將每個樣品的濃度稀釋到15-25nd/L。

1.2.2SSR分析PCR反應總體積為20μL：其中ddH20為14.4μL，10 xbuffer為2μL，2.5 mmol/LdNTP0.8μL，10pmol/L的上、下游引物各0.2μL，模板DNA為2μL，2.5U/uL Taq酶為0.4μL。在PCR儀上進行PCR擴增。反應步驟為：94℃預變性5min，94℃1min，50℃(45℃，52℃，53℃)45s，72℃1min，36個循環，72℃5min。反應結束后加入3μL變性膠buffer，95℃變性后置于冰盒中待用。

1.2.3銀染檢測電泳檢測采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠系統，緩沖液為IOxTBE，恒功率60W，電泳2h左右，銀染檢測，掃描并統計結果。

1.2.4田間性狀調查對46份材料的田間表現性狀進行調查，分別調查網紋、果形、單果質量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等12個性狀。

1.2.5數據處理和分析對擴增圖譜進行數據統計，強反應帶記“1”，弱反應帶重復出現記“1”，弱反應帶出現但不重復記“0”，無帶記“0”。用PHYLIP3.67數據軟件計算遺傳距離，用NTSYS軟件獲得相似系數矩陣：用其中UPGMA方法進行聚類分析，并通過Treeplot生成聚類圖。并將田間性狀觀察數據轉化為數字形式，有性狀的記為“1”。無性狀的記為“0”。利用同樣方法進行聚類分析。

2結果與分析

2.1SSR標記多態性分析

61對SSR特異引物對46份厚皮甜瓜材料進行分析(表2)，其中52對擴增出條帶，47對引物具有多樣性，平均每個引物可擴增出3.6條帶。等位位點的范圍在1-7個，引物CMAT141、CMCT44、CMGA165和CMTC168的等位位點數最多，其中以引物CMAT141對樣品的擴增產物為例，其擴增條帶的大小在175-450 bp。共有7個等位位點。在所有引物中擴增出2個等位位點的有13對引物，占所篩選引物的21.31％，片段大小在100～1250bp。擴增出5個位點以上的有16對引物，占所篩選引物的26.22％，片段大小在125～1000 bp；擴增出3～4個等位位點的有17對引物，占所篩引物的27.87％，片段大小在100～1500bp。見表2、圖1。

2.2分子聚類與親緣關系分析

為確定46份甜瓜材料的親緣關系，分別從基因型和田間性狀兩個方面進行了聚類分析。46份甜瓜材料的SSR標記的聚類圖，以SSR標記擴增結果對46份甜瓜材料進行UPGMA聚類分析。從SSR標記的聚類圖(圖2)上可以看出，以遺傳相似系數0.70為標準可將46份厚皮甜瓜的育種材料劃分為6類，第1類包括11份材料(No.21，No.26.No.32，No.36，No.37，No.48，No.72，No.44，No.46，No.74和No.76)，第2類包括16份材料(No.53，No.54，No.41，No.42，No.82，No.58，No.59，No.61，No.60，No.64，No.78，No.79，No.80，No.81，No.69和No.83)，第3類包括3份材料(No.62，No.77和No.71)，第4類包括5份材料(No.27，No.30，No.75，No.73和No.63)，第5類包括7份材料(No.29，No.31，No.38，No.40，No.39，No.55和No.56)，第6類包括4份材料(No.51，No.52，No.84和No.85)；同時，從SSR標記的聚類圖上可以看出。這46份厚皮

甜瓜材料的遺傳相似系數達到了0.62，說明材料間的親緣關系還是非常近的。

2.3性狀聚類與親緣關系分析

選擇甜瓜材料較穩定的12個表型性狀包括網紋、果形、單果質量、有無條帶、果皮顏色、果肉顏色、肉質、種子、有無麝香味、裂葉、是否自落和花性型等，轉化為數字的形式(表3)，對46份甜瓜材料進行了UPGMA聚類分析。從性狀聚類圖(圖3)可以看出，一些親緣關系很近的材料被聚到了一起，例如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40。No.51與No.52，No.53和No.54、No.55，No.56和No.59，No.73和No.74。其中No.30是No.29轉雌性系的BC5F3.No.31是No.29的BC6 No.40是No.39的BC5:No.52是No.51轉雌性系的BC4；No.54是No.53的BC4F2，No.55是No.53的BC4；No.59與No.56，No.73與No.74是姐妹系。以遺傳相似系數0.70為標準，可以將46份材料劃分為4類：第1類包括No.21、No.73、No.74、No.83、No.32、No.42、No.46、No.84、No.51、No.52、No.77、No.53、No.55、No.54、No.61、No.80、No.79、No.44、No.64、No.69、No.7l、No.81、No.29、No.30、No.31、No.78、No.48等27份材料；第2類包括No.26、No.37、No.63、No.27、No.75等5份材料；第3類包括No.62、No.82、No.76、No.56、No.59、No.58和No.72等7份材料：第4類包括No.38、No.39、No.40、No.41和No.60等5份材料。

2.4遺傳距離分析

利用phvlip3.67軟件對46份材料進行了100次的遺傳距離的運算，計算材料間的遺傳相似系數(geneticsimilarity，S)，根據遺傳相似系數(GS)計算相應的遺傳距離(geneticdistance，GD)。從計算結果看出，46份材料的遺傳距離值在0.0188～1.2119。其中No.21和No.26的遺傳距離最小，No.41和No.84的遺傳距離最大。一些親本和他們的回交后代如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40，No.44和No.46、No.48，No.51和No.52以及No.53和No.54、No.55，它們之間的遺傳距離都比較小，在0.0828～0.4975，而作為雜交壽研1、2、3、4號新品種親本的材料如21號與64號、29號與64號、44號與56號.它們之間的遺傳距離都在0.4以上。

將46份厚皮甜瓜材料按氣味、果皮顏色、果肉顏色和表面網紋等性狀分別進行分類，計算單一性狀之間的遺傳距離。不同果皮顏色之間的遺傳距離在0.0564～0.1543，其中白色果皮與淡綠色果皮的遺傳距離最大(表4)；不同果肉顏色之間的遺傳距離在0.0648～0.0931，其中以白色果肉和橘黃色果肉的遺傳距離較大(表5)；表皮不同網紋間的遺傳距離在0.0648～0.0931，其中光皮和密網紋的遺傳距離較大；在氣味方面，有麝香氣味和無麝香氣味的遺傳距離只有0.0391(表6)。可以看出，單一性狀間的遺傳距離都在0.1000以下，非常小。從SSR標記聚類結果和遺傳距離的計算可以看出，46厚皮份甜瓜材料中大部分的遺傳距離較近，這是由于所用材料是經由雜交選育而成的育種材料(自交系)，并且包括很多份親本及其雜交和回交后代。

3討論與結論

本試驗對46份厚皮甜瓜材料進行聚類分析并計算出遺傳距離，遺傳距離是研究品種間遺傳差異的重要參考依據，采用遺傳距離較遠的優良自交系進行雜交，改良品種得到具有優勢的雜交一代是雜交選育親本的原則之一。從性狀聚類的結果可以看出：具有相同親本和回交親本的材料遺傳差異較小，例如No.29與它的回交6代No.31.No.39與它的回交5代No.40。No.73、No.74與它們的親本之一No.64.No.75與它的親本之一No.27的親緣關系都較近，這與樂錦華等對厚皮甜瓜親緣關系的研究結果類似。即雜交后代和回交后代易與雙親或是親本之一聚在一起。

本試驗選用2種方法對46份材料進行了聚類分析。從結果可以看出，2種聚類結果存在較大的差異。一些回交后代和雜交后代在性狀聚類中能夠聚在一起。但在分子聚類中卻不一定能聚在一起。例如No.56與它的姐妹系No.58、No.59在分子聚類中沒有聚在一起，在性狀聚類中卻聚在一起。分子聚類的結果更多的從基因位點的角度反應了材料間的親緣關系，某些位點的差異不一定直接造成性狀表現的差異，性狀的聚類結果更容易將具有相同表型的材料聚到一起，能明顯揭示形態上的差異，本試驗只調查了1年的性狀數據，因此要想使性狀聚類更加準確，可以增加調查的性狀種類。采用幾年調查的平均值進行聚類。分子聚類與表型性狀聚類相比不易受環境的影響，相對于性狀聚類更加穩定；本試驗的分子聚類中沒有針對表型性狀選用引物，所用的引物并非直接與這些表型性狀有關，或者與表型性狀相關的引物所擴增出的位點數占全部引物位點比例太小，以致在分子聚類中無法區分不同的表型性狀，從而導致了2種聚類圖存在了較大的差異。

在結果的分析中采用phylip3.67軟件進行了100次的遺傳距離運算從而得出材料間的遺傳距離，通過對不同氣味、果皮顏色、果肉顏色和網紋遺傳距離的計算，可以看出材料的單一性狀間遺傳距離很近，均＜0.2。本試驗引物的覆蓋面積較廣，結果對于親本選配具有一定指導作用。由于這46份厚皮甜瓜材料都是育種材料。之間存在復雜的親緣關系，遺傳背景比較狹窄，要想在品種的選育中改變這個缺點，就需要選擇遺傳距離較大的材料進行雜交，才能獲得比較強的雜種優勢，同時引入親緣關系較遠的材料來改善育種材料的結構，改變遺傳背景狹窄的局限性。